胡　灃　朱　捷　張　迪　方　健

基金基金： 南京軍區(qū)醫(yī)學科學技術研究十一五重點課題(項目編號：09Z008)

作者單位： 230031　合肥　安徽醫(yī)科大學解放軍臨床學院(中國人民解放軍第105醫(yī)院)骨科(胡灃，朱捷，方健)

230061　合肥　安徽省醫(yī)學情報研究所(張迪)

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·基礎醫(yī)學·

海水浸泡對兔脊髓損傷后TNF-α及VEGF表達的影響

胡灃朱捷張迪方健

基金基金： 南京軍區(qū)醫(yī)學科學技術研究十一五重點課題(項目編號：09Z008)

作者單位： 230031合肥安徽醫(yī)科大學解放軍臨床學院(中國人民解放軍第105醫(yī)院)骨科(胡灃，朱捷，方健)

230061合肥安徽省醫(yī)學情報研究所(張迪)

[摘要]目的建立兔開放性脊髓損傷模型，觀察海水浸泡對兔開放性脊髓損傷后TNF-α、VEGF表達的影響。方法采用改良Allens打擊器造兔脊髓損傷模型。選用日本大耳兔，體質(zhì)量2.5～3 kg，雌雄不拘。根據(jù)隨機數(shù)字表，將60只大耳白兔隨機分為兩組，實驗組: 海水浸泡組(切除椎板并造脊髓損傷模型，海水浸泡60 min，n=30)，對照組: 單純損傷組(切除椎板并造脊髓損傷模型，不浸泡，n=30)。分別于致傷后1、6、12、24、48小時5個時間點取傷段脊髓，光鏡下觀察傷段脊髓組織病理形態(tài)，免疫組織化學染色和計算機圖形分析技術半定量化檢測TNF-α、VEGF表達。結果兩組脊髓組織均發(fā)生了創(chuàng)傷性水腫，但水腫高峰期的時間點不同, 單純損傷組致傷后6小時達水腫高峰，而海水浸泡組于致傷后12小時達水腫高峰。免疫組化檢測結果顯示TNF-α、VEGF在兩組中均有陽性表達，但兩組在各時間點表達強度有差異(P<0.05)，且海水浸泡組TNF-α、VEGF表達的高峰與對照組不同。結論海水浸泡早期延遲了創(chuàng)傷性脊髓損傷的病理改變，但最終發(fā)生的脊髓損害較對照組加重。TNF-α、VEGF的高表達與損傷有著密切關系，可作為海水浸泡脊髓損傷預后判斷、傷情評估的指標。

[關鍵詞]海水浸泡；脊髓損傷；腫瘤壞死因子α；血管內(nèi)皮生長因子

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是外科常見的嚴重損傷，通常分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。脊髓的原發(fā)性損傷是創(chuàng)傷本身造成的，包括不可逆性神經(jīng)細胞壞死、軸索斷裂等。繼發(fā)性損傷包括水腫、出血、炎癥反應、局部缺血等，特別是其中的水腫與能量代謝系統(tǒng)障礙更可引起一系列放大效應，使原有的脊髓損傷惡化。TNF-α是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中最早出現(xiàn)增高的細胞因子，可上調(diào)其他細胞因子的表達，可能是眾多細胞因子的重要啟動因子[1]。VEGF作為脊髓損傷后的一種保護因子，能促進新生毛細血管的形成而有效改善損傷局部的微循環(huán)。開放性脊髓損傷在海戰(zhàn)或海事作業(yè)等情況下并不少見，均不同程度受到海水浸泡。海水具有低溫、高滲、低堿性的特點，其作為一種特殊的環(huán)境因素對脊髓損傷的病理生理改變有重要影響。本研究通過建立海水浸泡脊髓損傷模型探討海水浸泡對開放性脊髓損傷的病理改變以及對TNF-α、VEGF表達的影響，為海水浸泡脊髓損傷的病理變化規(guī)律及傷情加重的機制提供一定的科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1人工海水配置根據(jù)國家海洋局第三研究所提供的人工海水配方配置，其主要指標：滲透濃度(1 250±12) mmol/L，pH 8.2，Na+濃度(630.0±5.0)mmol/L，K+濃度(10.88±0.68)mmol/L，Cl-濃度為(658.8±5.25)mmol/L，溫度(21±2)℃。具體配方如下(g/L)：氯化鈉26.518、氯化鎂2.447、硫酸鎂 3.305、氯化鈣1.141、氯化鉀0.725。

1.2動物模型制作與取材健康日本大耳兔60只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，根據(jù)隨機數(shù)字表隨機分為兩組，實驗組: 海水浸泡組(切除椎板并造脊髓損傷模型，海水浸泡60 min，n=30)，對照組: 單純損傷組(切除椎板并造脊髓損傷模型，但不浸泡，n=30)。兩組觀察時間點為1、6、12、24、48小時，每時間點6只動物。麻醉起效后以T10為中心做正中縱行切口，暴露T10段脊髓。在暴露的硬膜表面放置一5 mm×3 mm的弧形墊片，采用改良Allen`s打擊器，致傷能量20 g×5 cm制作脊髓損傷模型。致傷后可見兔雙后肢抽搐、尾巴搖擺，即造模成功。實驗組打擊成功后將兔固定在平板上直立浸泡于人工海水中，水面與胸骨柄上緣平齊，浸泡60 min。實驗完成后動物分籠飼養(yǎng)，每天注射抗菌藥物，按摩膀胱2次，協(xié)助其排尿。

1.3取材全部實驗動物按照分組分別在傷后1、6、12、24、48小時時間點進行取材，對實驗動物行戊巴比妥鈉按1 mL/kg 劑量經(jīng)耳緣靜脈麻醉，麻醉成功后，在劍突下剪開膈肌，暴露心臟，經(jīng)左心室插管至主動脈并固定，在右心耳處剪一小口放血，經(jīng)導管快速灌注磷酸鹽緩沖液，待流出清亮液體時，更換4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖固定液持續(xù)灌注，至兔四肢僵硬。以打擊致傷點為中心，取長約3 cm的脊髓標本，置于4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖固定液中固定24～48 h，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚5 μm，每份標本取5張切片，分別做HE染色、免疫組化染色。

1.4HE染色采用常規(guī)HE染色，協(xié)助免疫組織化學染色觀察脊髓組織損傷后組織形態(tài)學的改變。

1.5免疫組化染色常規(guī)脫蠟后，3%H2O2處理10 min,蒸餾水洗3次，每次2 min。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃～98℃ 10～15 min進行抗原修復，取出室溫冷卻。PBS沖洗，按免疫組化試劑盒說明書SP法進行染色。以PBS和加入生物素化山羊抗兔IgG代替一抗對照，37℃ 20 min,PBS沖洗，DAB染色，蘇木精復染，脫水封片。

1.6顯微圖像分析計算機病理圖像分析系統(tǒng)進行免疫組化染色半定量化分析免疫染色陽性神經(jīng)細胞的光密度值(optical density，OD)，代表TNF- α、VEGF所發(fā)生的免疫反應強度。400倍視野下，每張切片選取3個典型陽性染色區(qū)域并測定其光密度值，取其平均值，進行半定量化分析。

2結果

2.1實驗動物行為觀察實驗組及對照組各時間點動物后肢感覺、運動及反射功能均受損，雙后肢肌張力下降，大小便失禁。

2.2組織病理學改變

2.2.1脊髓大體形態(tài)觀察兩組脊髓打擊處及相鄰部位均不同程度的充血及水腫改變，但水腫高峰出現(xiàn)不一致。致傷1小時兩組脊髓組織大體形態(tài)相似，均出現(xiàn)明顯腫脹、充血，脊髓表面色澤暗淡，淺靜脈充血擴張，損傷局部充血程度差異不明顯。6小時對照組脊髓受打擊的部位充血范圍明星大于實驗組，12小時對照組脊髓充血范圍未見明顯擴大，而實驗組脊髓組織充血范圍顯著增大，并較對照組嚴重。對照組傷后6小時脊髓水腫達高峰，實驗組于致傷后12小時達水腫高峰。24、48小時兩組脊髓組織損傷未出現(xiàn)加重趨勢。

2.2.2HE染色致傷1小時實驗組與對照組損傷區(qū)域均出現(xiàn)散在出血灶，神經(jīng)細胞形態(tài)結構基本正常，胞漿及細胞核仍清晰可見，神經(jīng)細胞輕度水腫。6小時脊髓神經(jīng)細胞出現(xiàn)明顯腫脹，部分脊髓前腳多角細胞胞體明顯腫脹，對照組脊髓水腫程度明顯重于實驗組。傷后12小時脊髓灰質(zhì)中神經(jīng)細胞明顯減少，多數(shù)神經(jīng)元細胞出現(xiàn)胞漿空泡和核固縮現(xiàn)象，白質(zhì)出現(xiàn)軸突水腫、空泡變性，并有較多的炎性細胞浸潤，實驗組脊髓組織的損傷程度顯著重于對照組，并且在傷后24小時繼續(xù)加重，48小時灰質(zhì)和白質(zhì)中出現(xiàn)多量空泡，零星可見神經(jīng)細胞。詳見圖1。

圖1海水浸泡組HE染色結果

①海水浸泡結束后1小時神經(jīng)元細胞基本正常；②海水浸泡結束后6小時神經(jīng)細胞輕度腫脹；③海水浸泡結束后12小時神經(jīng)細胞出現(xiàn)包漿空泡及核固縮現(xiàn)象；④海水浸泡結束后24小時包漿空泡及核固縮現(xiàn)象增加；⑤海水浸泡結束后48小時脊髓灰質(zhì)中出現(xiàn)多量空泡，零星可見神經(jīng)細胞

2.3免疫組化染色TNF-α主要位于神經(jīng)元胞漿及突起中，細胞核不著色。兩組致傷后1小時即可見TNF-α陽性表達，此后表達逐漸增強，對照組TNF-α的陽性表達光密度值于6小時達高峰，此后逐漸下降，24、48小時仍有表達。實驗組于12小時達峰值，除1、6小時TNF-α表達強度低于對照組，其他各時間點表達強度均較對照組高,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。脊髓神經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞均可表達VEGF，兩組于致傷后1小時即可見VEGF陽性表達，此后表達逐漸增強，實驗組與對照組VEGF陽性表達光密度值分別于24小時、12小時達高峰，48小時仍有較高表達。各時間點表達強度實驗組均較對照組有差異(P<0.05)。對照組各時間點脊髓組織TNF-α免疫組化染色見圖2，實驗組各時間點脊髓組織TNF-α免疫組化染色見圖3，對照組各時間點脊髓組織VEGF免疫組化染色見圖4，實驗組各時間點脊髓組織VEGF免疫組化染色見圖5，兩組TNF-α、VEGF陽性表達光密度值見表1。

表1兩組實驗動物脊髓損傷各時間點TNF-α、

①脊髓損傷后1小時TNF-α表達強度較低；②脊髓損傷后6小時TNF-α表達強度明顯增強并達高峰；③脊髓損傷后12小時TNF-α表達開始下降；④⑤脊髓損傷后24小時及48小時TNF-α仍有一定的表達，強度均較前下降

①脊髓損傷后1小時TNF-α表達強度較低；②脊髓損傷后6小時TNF-α表達強度明顯增強；③脊髓損傷后12小時TNF-α表達強度達高峰；④⑤脊髓損傷后24小時及48小時TNF-α仍有一定的表達，強度均較前下降

①脊髓損傷后1小時VEGF表達強度較低；②脊髓損傷后6小時VEGF表達強度較前增強；③脊髓損傷后12小時VEGF表達強度達高峰；④⑤脊髓損傷后24小時及48小時VEGF仍有一定的表達，強度均較前下降

①脊髓損傷后1小時VEGF表達強度較低；②③脊髓損傷后6小時及12小時VEGF表達強度均較前增強；④脊髓損傷后24小時VEGF表達強度達高峰，以神經(jīng)元細胞表達較為明顯；⑤脊髓損傷后48小時VEGF仍有一定的表達，強度均較前下降

3討論

脊髓損傷是外界直接或間接因素導致的一種較為嚴重的中樞神經(jīng)損傷。脊髓損傷包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷，其中繼發(fā)性損傷是脊髓損傷急性及亞急性期的重要組成部分。炎癥反應是脊髓繼發(fā)性損傷病理生理中的重要組成部分，是導致脊髓損傷加重的主要因素之一[2]。TNF-α是體內(nèi)具有多種生物活性的炎性細胞因子,在炎癥反應及免疫調(diào)節(jié)等方面起重要作用。TNF-α也是參與SCI炎癥反應的重要細胞因子，在脊髓損傷的早期即有表達，并介導相應的炎性細胞侵入受損脊髓局部產(chǎn)生炎性反應，從而加重脊髓的損傷[3]。有研究[1]表明，TNF-α是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷最早出現(xiàn)增高的細胞因子，可上調(diào)其他細胞因子，可能是眾多細胞因子的重要啟動因子。VEGF是一種糖蛋白，通過與其受體作用促進脊髓微血管形成，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用。VEGF改善受損脊髓微循環(huán)主要是通過激活血管內(nèi)皮細胞釋放NO，增加損傷脊髓的局部血流量，促進新生毛細血管的形成[4]。VEGF作為脊髓損傷后的一種保護因子，還能促進軸突再生，對脊髓殘存神經(jīng)元的存活及損傷修復起到重要作用[5]。

海水具有低溫、高滲透壓、高電解質(zhì)濃度以及含有微生物等特性[6]。本實驗在脊髓損傷的基礎上引入了海水這一特殊理化因素，目前國內(nèi)外已經(jīng)對海水合并胸腹部、四肢、顱腦、皮膚等損傷進行了相關研究，從各個方面、不同角度闡述了海水對各部位原發(fā)傷的影響機制[7-10]。但海水合并脊髓損傷的相關研究在國內(nèi)外均尚少見。

本實驗在脊髓損傷的基礎上進行了人工海水的浸泡處理，結合免疫組化染色觀察脊髓組織創(chuàng)傷部位炎癥因子TNF-α、VEGF的表達情況。實驗結果顯示，對照組TNF-α的陽性表達光密度值于6小時達高峰，此后逐漸下降，24、48小時仍有表達。海水浸泡組于12小時達峰值，除1、6小時TNF-α表達強度低于對照組，其他各時間點表達強度均較對照組高，差異有統(tǒng)計學意義。這一結果提示海水浸泡對脊髓損傷早期病理變化有一定的抑制作用，但后期造成的損傷更為嚴重。脊髓繼發(fā)性損傷是多種細胞因子參與并調(diào)節(jié)誘導的炎癥反應過程，脊髓損傷后局部缺血缺氧，炎性細胞因子表達增加，介導炎性細胞浸潤，造成組織壞死。TNF-α是脊髓損傷早期表達的炎癥因子之一，不但促進白細胞在缺血區(qū)的聚集和浸潤，還可誘導脂質(zhì)過氧化物、氧自由基等的產(chǎn)生，這些有害毒素進一步刺激單核巨噬細胞TNF-α的表達，造成炎癥的放大效應，從而加重脊髓組織的損傷[11]。由于海水低溫、高滲、低堿性的特點，對開放性脊髓損傷局部的血流、電解質(zhì)造成顯著影響。低溫可以降低脊髓組織代謝需求及氧耗量, 減少乳酸蓄積，還能抑制內(nèi)源性毒性產(chǎn)物對神經(jīng)組織的毒害[12]。在海水浸泡組早期可能是因為海水的低溫特性暫時抑制了損傷的加重，故實驗組1、6小時TNF-α表達強度低于對照組。胡勇等[13]研究也表明低溫對脊髓損傷后炎癥細胞因子TNF-α分泌有一定的抑制作用。在海水浸泡組后期脊髓損傷局部的微循環(huán)障礙，組織缺血缺氧，血管通透性增強，血管內(nèi)微血栓形成等加劇了炎癥反應。同時海水的高離子濃度直接刺激傷區(qū)的組織細胞釋放IL-8、腫瘤壞死因子、NO等炎性介質(zhì)，海水的堿性成分也能增加細胞的損傷, 促使細胞崩解和磷脂釋放, 發(fā)生脂質(zhì)過氧化。這些影響因素可能是導致海水浸泡組脊髓組織中TNF-α表達顯著增高的原因。實驗結果顯示兩組于致傷后1小時即可見VEGF陽性表達，此后表達逐漸增強，實驗組與對照組VEGF陽性表達光密度值分別于24小時、12小時達高峰，48小時仍有較高表達。有研究[14]顯示，VEGF通過促進血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖及新生血管形成，清除壞死組織，有利于損傷組織的重建和修復，是對組織缺氧的保護性反應。

本實驗海水浸泡組各時間點VEGF的表達強度均高于對照組，在一定程度上說明海水加重了脊髓局部組織缺氧。這可能是由于血管及損傷組織處于海水的高滲環(huán)境中，組織細胞脫水，海水的高滲、堿性特點干擾了細胞膜的物質(zhì)運輸和能量轉換，促進炎性介質(zhì)釋放，細胞功能受損，細胞缺氧更加嚴重，誘導VEGF表達上調(diào)。海水的低溫特性可引起供給脊髓的血管痙攣收縮，局部的血流量下降，組織缺血缺氧加重，這可能是導致VEGF升高的另一原因。兩組中TNF-α與VEGF表達高峰呈一前一后態(tài)勢(對照組TNF-α于6小時達高峰，VEGF于12小時達高峰；實驗組TNF-α于12小時達高峰，VEGF于24小時達高峰)，這也是脊髓損傷過程中損傷因子與修復因子的相互制約、相互影響的病理生理現(xiàn)象。

海水獨特的理化性質(zhì)對脊髓損傷早期的病理改變有一定的抑制作用，延遲了脊髓損傷后創(chuàng)傷性水腫以及抑制了相關炎性因子的表達，但最終海水浸泡加重了脊髓繼發(fā)性損傷。通過本實驗我們可以看出海水浸泡對脊髓損傷的病理過程的影響。TNF-α高表達所導致的過度炎癥反應，和VEGF的保護性反應貫穿整個過程。這兩種細胞因子可作為海水浸泡脊髓損傷預后判斷、傷情評估的指標。脊髓損傷早期干預措施(如免疫炎癥抑制劑、高壓氧、大劑量激素、VEGF等)多是在傷后6～8 h內(nèi)，而對于合并海水浸泡脊髓損傷的治療時間窗要延遲至傷后12小時才可能較有力地改善此類傷者的預后。

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(2014-10-15收稿2015-01-20修回)

Influence on the neural cell expression of TNF-α and VEGF of spinal cord injury with seawater immersion

HuFeng,ZhuJie,ZhangDi,etal

DepartmentofOrthopedics,thePLAClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity(PLA105thHospital) ,Hefei230031,China

[Abstract]ObjectiveTo establish model of spinal cord injury with seawater immersion,observe the influence on neural cell expression of TNF-α and VEGF.MethodsThe rabbit model of spinal cord injury were built based on modified Allensmethod.According to random digital table,60 rabbits were randomly divided into two groups, experimental group: cut vertebral plate and damaged spinal cord with seawater immersion(n=30,and the immersion time is 60 minutes). Control group:cut off vertebral plate and damaged spinal cord without seawater immersion(n=30).Two groups randomly divided into five groups based on 1 hour,6 hours,12 hours,24 hours,48 hours after immersion. The animals were sacrificed at every timepoint,and pathological of spinal cord was studied by light microscopy, immunohistochemistry was used to test the expression of TNF-α and VEGF.ResultThe traumatic spinal cord edemous peak of control group at the timepoint of 6 hours,but the peak of experimental group was postponded to the 12 hours. Immunohistochemistry showed positive expression of TNF-α, VEGF are in two groups,but the expression strength of two groups has notable diffence in each timepoint(P<0.05). And the expression peak of TNF-α, VEGF is diffrent in two groups. ConclusionSeawater immersion delayed traumatic spinal cord injury in early stage, but it aggravated spinal cord injury finally. The high expression of TNF-α, VEGF indicated a close relationship with injury, these two kind of proteins can be used as judgement of prognosis and injury assessment of spinal cord injury with seawater immersion.

[Keywords]Seawater immersion; Spinal cord injury; Tumor necrosis factor-α(TNF-α); Vascular endothelial growth factor(VEGF)

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.11.001

通信作者：方健，fj105yy@163.com