肖勝南 張云卿 侯 婷 王 巍 薛 飛 王 瑾 楊龍峰
(北京市延慶縣動物疫病預防控制中心,北京 102100)
PAG-ELISA 在奶牛早期妊娠診斷上的應用研究
肖勝南 張云卿 侯 婷 王 巍 薛 飛 王 瑾 楊龍峰*
(北京市延慶縣動物疫病預防控制中心,北京 102100)
本課題研究旨在針對人工輸精后的28~45 d的奶牛,分別采用PAG-ELISA方法和B超檢測進行早期妊娠診斷,比較實驗結(jié)果,評價PAG-ELISA檢測方法對配種28~45 d的奶牛進行早期妊娠診斷的準確性。結(jié)果表明,PAG-ELISA妊娠診斷的特異性、敏感性、陰性預測值、陽性預測值和準確性分別為93.2%、100%、100%、97.4% 和98.1%,Kappa為0.952。PAG-ELSIA 檢測方法和B超妊娠診斷結(jié)果符合率高,可用于母牛的早期妊娠診斷。
PAG-ELISA B超檢查 早期妊娠診斷
開展精準及時的奶牛早期妊娠診斷在現(xiàn)代規(guī)模養(yǎng)殖場中對于易流產(chǎn)母牛的保胎、牛群的分群管理及提高繁殖效率等有著舉足輕重的作用。目前,國內(nèi)主要依賴B超、直腸觸診進行奶牛早期妊娠診斷,而國外奶牛養(yǎng)殖發(fā)達國家除了采取B超、直腸觸診進行奶牛早期妊娠診斷外,采取檢測血液中妊娠相關(guān)糖蛋白(PAGELISA方法)進行奶牛早期妊娠診斷,并得到快速推廣與應用。據(jù)相關(guān)資料調(diào)查,國內(nèi)某些大型牧場也開始使用PAG-ELISA方法進行奶牛早期妊娠診斷,但對其臨床使用效果及其影響評估資料甚是欠缺。
為了分析、利用、評估PAG-ELISA檢測奶牛早期妊娠診斷的實際應用效果與影響,筆者通過B超、妊娠相關(guān)糖蛋白ELISA兩種方法臨床試驗比較研究,于2014年1~5月對延慶縣4個牛場260頭配種后28~45 d的荷斯坦奶牛使用基于妊娠相關(guān)糖蛋白PAGELISA的商品化試劑盒進行早期孕檢診斷,并在采集血樣的同一時間開展B超妊娠診斷確認,比較分析快速PAG-ELISA的實際應用效果與影響,為PAG-ELISA 推廣應用提供參考依據(jù)。
1.1 試驗動物
選取配種后28~45 d的荷斯坦黑白花奶牛260頭,采集靜脈血液4 ml,送檢實驗室進行PAG-ELISA快速妊娠診斷。
1.2 試劑
牛懷孕檢測試劑盒由北京愛德士元亨生物科技有限公司提供。批次04-41169-02,有效期至2014年5月31日。
1.3 PAG-ELISA方法原理
反芻動物胎兒胎盤的滋養(yǎng)層雙核細胞在與母體子宮上皮細胞融合時,會釋放包括PAG在內(nèi)的物質(zhì)到母畜血液中。PAG的濃度隨著妊娠開始呈緩慢上升,直至分娩;相關(guān)研究表明,配種1個月后妊娠奶牛與非妊娠奶牛PAG濃度出現(xiàn)顯著差異。因此,在此時檢測PAG可以成為盡早診斷奶牛妊娠與否的關(guān)鍵指標。IDEXX牛懷孕檢測試劑盒是根據(jù)酶聯(lián)免疫反應原理設計的,用于檢測妊娠早期存在外周循環(huán)中的PAG,通過微孔板包被純化的PAG抗體,捕獲到的外周循環(huán)中的PAG可以與特異性的純化的PAG抗體和辣根過氧化物酶標記物結(jié)合,隨后加入TMB底物溶液顯色,孔內(nèi)溶液的顏色深淺與樣品中PAG的含量成比例,此判斷妊娠與否。
1.4 IDEXX牛懷孕檢測試劑盒操作步驟及結(jié)果判讀
將待檢奶牛血清和IDEXX 牛懷孕檢測試劑盒恢復到室溫,按照試劑盒說明書操作步驟進行,檢測待檢奶牛的妊娠狀況。
陽性對照的平均值(PC)與陰性對照的平均值(NC)之差必須大于或等于0.300,另外,陰性對照的平均值(NC)必須小于或等于0.150,實驗結(jié)果才有效。
具體結(jié)果詮釋方法為:動物的懷孕狀態(tài)是由計算每份樣品的S-N值決定的。被檢樣品的S-N值<0.300的,檢測結(jié)果為陰性,表示此動物沒有懷孕(空懷);被檢樣品的S-N值≥0.300的,檢測結(jié)果為陽性,表示此動物被認為是懷孕。
1.5 奶牛懷孕B超檢查結(jié)果判斷
經(jīng)過PAG ELISA 妊娠診斷,做好相關(guān)檢測結(jié)果,并在同一時間進行B超妊娠診斷確認。B超妊娠診斷未懷孕奶牛為空懷牛,若懷孕診斷為妊娠牛。
1.6 結(jié)果分析
在結(jié)果判定中,特異性為空懷牛樣品中PAG檢測結(jié)果為陰性的比例;敏感性為妊娠牛樣品中PAG酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果為陽性的比例;結(jié)果的陰性預測值為PAG檢測為空懷的牛確定為真實為空懷的比例;結(jié)果的陽性預測值為PAG檢測為已孕的牛確定為真實妊娠的比例;結(jié)果的準確性為PAG檢測的妊娠狀況(妊娠+空懷)與B超診斷結(jié)果一致的比例。
1.7 統(tǒng)計與分析指標
利用Kappa值對懷孕相關(guān)蛋白PAG-ELISA 同B超診斷結(jié)果進行一致性評價。Kappa值為1表明完全符合,0為完全不符。在比較性試驗中,Kappa值在0.4~0.5之間,說明符合率中等;0.5~0.6說明符合率良好;大于0.6說明符合率很高。
在試驗期間,對260頭奶牛分別使用B超檢查(配種后28~45 d)和PAG-ELISA試劑盒2種方法進行妊娠診斷,對獲得的結(jié)果進行比對分析。檢測結(jié)果:利用PAG ELISA試劑盒共檢測出69頭奶牛陰性(空懷),191頭奶牛陽性(懷孕)。在用B超檢查時發(fā)現(xiàn),使用PAG ELISA試劑盒檢測為陰性(空懷)的69頭牛全部為空懷。
PAG-ELISA 檢測為陽性(懷孕)的191頭牛中,用 B超檢查時發(fā)現(xiàn)其中的186頭已孕,而5頭為空懷。為了分析PAG ELISA試劑盒檢測結(jié)果的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和準確性,建立了2×2列聯(lián)表(見表1),并在表2中列出了以B超為標準,評估PAG ELISA試劑盒的準確性。
從表1可以得出,PAG ELISA試劑盒妊娠診斷的特異性、敏感性、陰性預測值、陽性預測值和準確性分別為93.2%、100%、100%、97.4% 和98.1%,Kappa為0.952。PAG ELSIA 試劑盒和B超妊娠診斷結(jié)果符合率極高
為了解PAG-ELISA 妊娠診斷結(jié)果的特異性①、敏感性②、陰性預測值③、陽性預測值④和準確性⑤的2×2列聯(lián)表評估表(N=260),詳見表1。
表1 PAG-ELISA 妊娠診斷和B超妊娠診斷情況比較
人工配種后通過B超診斷評價PAG-ELISA方法的特異性、敏感性、陰性預測值、陽性預測值和準確性,結(jié)果詳見表2。
表2 B超評價PAG-ELISA方法的結(jié)果統(tǒng)計
本研究結(jié)果表明:兩種妊娠診斷方法的一致率=(a+d)/ N*100=(186+69)/260=0.981。表1數(shù)據(jù)代入Kappa方程,Kappa值為0.952,分析得出,本試驗表明PAG ELISA方法和B超診斷兩種妊娠診斷結(jié)果符合率很高,應用PAG ELISA 方法完全能夠用于奶牛早期妊娠診斷。
在本研究中,PAG ELISA試劑盒檢測母牛妊娠診斷的特異性、敏感性、陰性預測值、陽性預測值和準確性分別為93.2、100、100、97.4 和98.1,與B超診斷結(jié)果相同,表明該方法可用于奶牛的早期妊娠診斷。Silva等評估PAG判斷妊娠狀況準確性試驗中得出,PAG檢測方法的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和準確性分別為96.8%~98.9%、91.7%~97.3%、89.7%~93.8%、97.5%~99.5% 和93.9%~97.8%,本研究與Silva等的研究一致。數(shù)據(jù)表明采用PAG ELISA試劑盒檢測奶牛早期妊娠診斷的敏感性和陰性預測值均很高,便于篩查空懷牛,利于讓技術(shù)員查找原因,盡早采取相關(guān)措施,如病原性開展治療、健康的準備再次配種,以縮短產(chǎn)犢間隔,提高牧場的生產(chǎn)效益。
據(jù)資料調(diào)查,揚州大學動物科學與技術(shù)學院賈國慧、王杏龍、王亮等在《奶牛B超妊娠診斷應用研究》的比較實驗中,B超在奶牛配種后29~60 d診斷準確率均為100%,故本實驗選擇在28~45 d期間采用PAG-ELISA 與B超同一時間進行妊娠診斷,在保證時間的統(tǒng)一下也保證B超檢測結(jié)果的準確性。陽性預測值沒有達到100%,這可能是在奶牛懷孕早期,胚胎早期死亡,用B超檢測不到胚胎,檢測結(jié)果為陰性,但是血液中PAGs蛋白還是在會在母牛體內(nèi)存在及循環(huán)一段時間,從而導致PAG-ELISA檢測出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象?;谠诒敬窝芯空n題中陰性預測值100%,未出現(xiàn)假陽性,這一檢測指標對牧場的繁殖管理至關(guān)重要,繁育人員不會錯誤的為已妊娠牛只進行再次配種處理,造成妊娠奶牛流產(chǎn)。
通過B超與PAG ELISA檢測方法的比較研究,PAG-ELISA檢測方法是可靠的、準確的。尤其適用于大型牧場,這對牧場的進一步標準化,規(guī)范化管理,提高生產(chǎn)養(yǎng)殖效益有著不可低估的作用;相關(guān)地區(qū)部門也可用此診斷方法,適當收取檢測費用,組織當?shù)啬翀霾捎肞AG ELISA方法開展奶牛早期妊娠診斷,這對提升當?shù)啬膛pB(yǎng)殖技術(shù)水平,提高牧場養(yǎng)殖生產(chǎn)效益有很大的促進作用。
近年來,應用PAG-ELISA方法來進行奶牛早期妊娠診斷取得了很大的進步,但還存在著一些局限性。一是該方法進行奶牛早期妊娠診斷需要配備相關(guān)的檢測設備,一般奶牛場無法獨立完成,需要送檢相關(guān)實驗室開展檢測。二是對配種28d以內(nèi)奶牛妊娠診斷的準確性有待進一步提高;三是檢測成本費用高,據(jù)調(diào)查,國內(nèi)還未研發(fā)相關(guān)成熟產(chǎn)品,均采用進口檢測試劑盒,檢測成本高,檢測費用在40~50元一頭。
參考最新放射免疫和酶聯(lián)免疫等技術(shù)的發(fā)展趨勢,隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展與更新,檢測血清中PAG的檢測方法也將更簡便,檢測結(jié)果也將更準確,檢測成本將會更低廉,檢測PAG方法大范圍推廣應用,替代直腸檢測、黃體酮檢測、B超等傳統(tǒng)早期妊娠診斷方法將會成為現(xiàn)實,這將推動奶牛業(yè)發(fā)展到一個新的生產(chǎn)水平。
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得到現(xiàn)代奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團隊,2013年國家自然科學基金項目(71373025),2010年教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-10-009資助)。
肖勝南(1981-),研究生,研究方向:動物疫病診斷與畜牧技術(shù)推廣。
楊龍峰(1976-),男,研究生,研究方向:動物疫病防制及畜牧技術(shù)推廣。