高海崗 王子平 任曉曄 陸建榮

（蘇州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇蘇州 215000）

A型流感金標(biāo)快速檢測試紙條的研制及初步應(yīng)用

高海崗 王子平 任曉曄 陸建榮

（蘇州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇蘇州 215000）

H5N1、H7N9、H9N2禽流感的頻發(fā)，給養(yǎng)雞業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失，同時，給公共衛(wèi)生帶來了極大的挑戰(zhàn)。為了快速檢測出流感感染的畜禽，利用兩株抗禽流感病毒NP蛋白特異性單克隆抗體3F3，4F11研制了禽流感（AIV）快速檢測試紙條。結(jié)果表明該試紙條有良好的特異性，與H5、H7、H9均有良好的反應(yīng)性，與雞新城疫病毒、雞白血病病毒沒有交叉反應(yīng)。應(yīng)用該檢測試紙條檢測300份臨床樣本，與進(jìn)口試劑條檢測結(jié)果做比較，吻合率達(dá)91.6%，其中H5吻合率達(dá)100%，H9吻合率達(dá)85.1%。該試紙條的研制，為基層快速檢測禽流感提供了條件。

流感 檢測 試紙條

自我國2000年爆發(fā)流感以來，相繼發(fā)生H5N1、H9N2、H7N9多型流感。流感病毒為RNA病毒，正粘病毒科，快速檢測畜禽體內(nèi)是否感染流感病毒，比較免疫前免疫后帶毒水平，具有極高的公共衛(wèi)生意義。本研究利用2株抗AIV-NP蛋白特異性單克隆抗體3F3，4F11研制了AIV快速檢測試紙條，具有良好的特異性和較高的敏感性。

1 材料

1.1 主要試劑與材料

氯化金、檸檬酸三鈉、BSA購自Sigma，抗AIV-NP蛋白特異性單克隆抗體3F3、4F11來源于揚州大學(xué)，NC膜、玻璃纖維購自上海捷寧生物科技有限公司、吸水紙、PVC地板購自蘇州眾達(dá)。

1.2 主要儀器

數(shù)顯磁力攪拌加熱器，購自常州；紫外分光光度計，購自上海；連續(xù)劃膜儀、噴金儀，購自杭州。

2 方法

2.1 膠體金的制備

準(zhǔn)確量取100 ml的超純水，倒入洗凈的錐形瓶中，把錐形瓶放在電爐上加熱，然后用移液槍移取1 ml 1%的氯化金溶液加入到超純水中，終濃度為0.01%，煮沸。待其沸騰后加入一定量的1%的檸檬酸三鈉溶液，振蕩混勻。待煮至顏色發(fā)生變化后，計時5 min，之后取下錐形瓶，冷卻至室溫。

2.2 膠體金-抗體復(fù)合物的制備

2.2.1 確定最佳pH

取1 ml的膠體金，加0.2 M碳酸鉀調(diào)不同的pH；緩慢加入單克隆抗體3F3到膠體金溶液中，攪拌45 min；穩(wěn)定后加10%的NaCl 溶液至終濃度1%，30 min后觀察。

2.2.2 確定最佳標(biāo)記蛋白量

取1ml的膠體金，加碳酸鉀調(diào)至最佳的pH；緩慢加入不同濃度的單克隆抗體3F3到膠體金溶液中，攪拌45 min；穩(wěn)定后加10%的NaCl 溶液至終濃度1%，30 min后觀察。

2.2.3 制備膠體金-抗體復(fù)合物

取10 ml的膠體金，加碳酸鉀調(diào)至最佳的pH；緩慢加入到適量的單克隆抗體3F3至膠體金溶液中，攪拌45 min；加入10%BSA至終濃度1%，攪拌40 min；4 ℃，離心，棄去上清，用復(fù)溶液復(fù)溶至原體積的20%。

2.3 試紙條的制備

2.3.1 C線、T線制備

C線用羊抗鼠二抗，濃度為1.0 mg/ml，1.5 mg/ml，2.0 mg/ml，劃膜。T線用4F11單克隆抗體，濃度為0.6、0.8、1.0、1.2 mg/ml，劃膜。

2.3.2 金標(biāo)墊制備

取制備的濃縮金標(biāo)抗體，按照15、20、25、30、35 μl/cm不同的噴量均勻噴涂于玻璃纖維，37 ℃烘干。

2.3.3 試紙條組裝

將金標(biāo)抗體、吸水紙、樣品墊按順序組裝，按照4.0 mm切條，測試效果。

2.4 試紙條性能檢測

2.4.1 特異性檢測

分別用ALV、NDV、AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9亞型滅活流感病毒，PBS稀釋液，檢測試紙條特異性。

2.4.2 靈敏度檢測

用原核表達(dá)的AIV-NP蛋白按照不同的稀釋倍數(shù)，檢測試紙條的靈敏度。

2.4.3 穩(wěn)定性檢測

隨機(jī)選取同批次的10根試紙條以及不同批次的各10根試紙條用相同抗原檢測，檢測其穩(wěn)定性。

2.4.4 臨床樣本檢測

檢測臨床樣本300份，同時用進(jìn)口試紙條檢測，檢測其樣本符合率。

3 結(jié)果

3.1 最佳pH

當(dāng)加入10%NaCl溶液20 min后，pH在7.0后顏色不變。取不同pH值的金標(biāo)抗體，測其OD526值并繪制曲線，確定金標(biāo)抗體的最佳標(biāo)記pH值為8.94。

3.2 最佳標(biāo)記蛋白量

將膠體金pH值調(diào)到894，每毫升膠體金標(biāo)記不同量的抗體，加入10%NaCl溶液后，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的蛋白量從15 μg后開始穩(wěn)定，顏色不再變化。取標(biāo)記不同蛋白量的金標(biāo)抗體，測其OD526值，繪制曲線，確定最小標(biāo)記抗體量為 15μg，所以最佳標(biāo)記量定為18μg。

3.3 試紙條組裝測試

將C線、T線、金標(biāo)抗體按照不同的組合一一配對，用PBS緩沖液檢測，確定最佳的C線濃度為1.5 mg/ml，T線濃度為1.2 mg/ ml。用表達(dá)的AIV-NP蛋白檢測，確定最佳的金標(biāo)墊噴量為35μl/ cm。

3.4 特異性

分別用試紙條檢測AIV-H9、AIV-H7、AIV-H5、NDV，ALV同時用PBS緩沖液做陰性對照。結(jié)果試紙條與AIV--H9、AIV-H7、AIV-H5有良好的反應(yīng)，與ALV、NDV無反應(yīng)，證明試紙條具有良好的特異性。

1：H9滅活菌液；2：H7滅活菌液；3：H5滅活菌液；4：NDV滅活抗原；5：ALV表達(dá)抗原；6：PBS。

3.5 靈敏度

用原核表達(dá)的NP蛋白對試紙條進(jìn)行檢測，檢測NP蛋白的檢測下限位3×10-6mg/ml。與商業(yè)化的檢測卡做比較，略高于其檢測下限。

稀釋倍數(shù)：1：100倍、2：1 000倍、3：10 000倍、4：100 000倍、5：1 000 000倍，6、7為空白對照。

3.6 重復(fù)性

隨機(jī)選取同批次的10根試紙條以及不同批次的各10根試紙條用相同抗原檢測其重復(fù)性，重復(fù)率100%。用相同方法，不同操作人進(jìn)行檢測，達(dá)到相同結(jié)果，證明試紙條具有穩(wěn)定的重復(fù)性。

3.7 臨床樣本檢測效果比較

用制備好的試紙條檢測臨床樣本300份，檢測結(jié)果如下表：

表1 臨床樣本檢測結(jié)果

自制試紙條共檢測83份陽性樣本，分型檢測H536份，H947份，陰性217份，進(jìn)口試紙條檢測76份陽性樣本，分型檢測H536份，H940份，陰性224份，陽性吻合率達(dá)91.6%，其中H5吻合率達(dá)100%，H9吻合率達(dá)85.1%。

4 討論

在膠體金制備過程中，還原劑檸檬酸三鈉對膠體金顆粒的大小起決定性作用，顆粒的大小隨著用量的增加而變小。

特異性是衡量試紙條能否運用的關(guān)鍵因素，由于樣本的復(fù)雜性，要求抗體標(biāo)記金的穩(wěn)定性高，盡量減少金的非特異性吸附，最后選用40 nm的金。試紙條經(jīng)過金標(biāo)墊，NC膜的優(yōu)化，最終檢測流感NP蛋白的下限為3 ng/ml。

初步應(yīng)用試紙條檢測臨床樣本，同時與某進(jìn)口品牌比較，二者吻合率較高。陽性吻合率達(dá)91.6%，其中H5吻合率達(dá)100%，H9吻合率達(dá)85.1%。初步證明本試紙條可以快速、準(zhǔn)確的檢測流感病毒，能夠應(yīng)用于臨床，為基層快速檢測提供條件。

資金來源：江蘇省三新工程SXGC（2013）091