朱真，萬建青，楊挺英，康凱

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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支原體培養(yǎng)基質(zhì)控菌株菌種代次與生長曲線研究

朱真，萬建青*，楊挺英，康凱

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為探究支原體液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基質(zhì)控菌豬鼻支原體生長規(guī)律，以活菌濃度，菌液pH值為指標(biāo)，比較了不同代次與不同傳代方式豬鼻支原體生長情況。結(jié)果顯示：3%與10%濃度傳代，0～48 h內(nèi)，活菌濃度持續(xù)上升，菌液pH值持續(xù)下降，3%濃度傳代的支原體生長較均勻，更利于菌種生長；1～5代支原體活菌濃度無顯著差異；通過0.3 mL菌液加9.7 mL培養(yǎng)基傳代，20組菌液平均濃度為(24.4±5.7)×108CFU/mL，通過0.9 mL菌液加29.1 mL培養(yǎng)基傳代，菌液平均濃度為(7.2±2.1)×108CFU/mL，兩種濃度差異極顯著，前種傳代方式更有利于支原體生長。本次試驗(yàn)為支原體液體和固體培養(yǎng)基的質(zhì)控工作標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。

豬鼻支原體；培養(yǎng)基質(zhì)控；菌種代次；生長曲線

支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見和棘手的污染源，培養(yǎng)法是支原體檢驗(yàn)的常用方法[1-3]。國內(nèi)已有通過生長滴度測(cè)定法，獲得牛支原體OF2株、山羊支原體山羊肺炎亞種分離株M1601在不同培養(yǎng)基中生長曲線的報(bào)道[4-5]，也有人通過活菌計(jì)數(shù)測(cè)定法獲得人型支原體(Mh)生長曲線[6]。測(cè)定不同時(shí)刻牛支原體的OD值和pH，亦可繪制該株牛支原體的生長曲線，但只能是在一定程度上反映生長趨勢(shì)，而無法進(jìn)行計(jì)量描述，有一定局限性[7]。

豬鼻支原體(CVCC361)作為支原體液體培養(yǎng)基和支原體固體培養(yǎng)基的質(zhì)控菌株[8]，其生長曲線于2012年被國內(nèi)學(xué)者繪制完成，但就培養(yǎng)基質(zhì)控菌株的標(biāo)準(zhǔn)化工作而言，其傳代次數(shù)、菌液接種適宜比例、生長滴度變化等還需進(jìn)一步考證[9]。為彌補(bǔ)這一研究空缺，本試驗(yàn)就豬鼻支原體菌液活菌濃度與pH值變化關(guān)系以及適宜傳代代次等進(jìn)行了研究，旨在為支原體液體培養(yǎng)基和支原體固體培養(yǎng)基的質(zhì)控工作的標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 豬鼻支原體(CVCC361)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 支原體液體培養(yǎng)基、支原體固體培養(yǎng)基，均由北京中海生物科技有限公司提供。

1.1.3 儀器 生物安全柜，NUAIR公司；CO2培養(yǎng)箱和37 ℃培養(yǎng)箱，SANYO公司；pH計(jì)，METTLER TOLEDO公司；渦旋震蕩器，北京金紫光科技發(fā)展有限公司；冰箱，海爾公司。

1.2 方法

1.2.1 不同接種濃度和收獲時(shí)間差異比較

1.2.1.1 菌液制備 將豬鼻支原體凍干菌株啟開，用支原體液體培養(yǎng)基恢復(fù)原體積，再以10%比例接種至支原體液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，分別按3%(將0.9 mL菌液加至29.1 mL支原體液體培養(yǎng)基中)和10%(將3 mL菌液加至27 mL支原體液體培養(yǎng)基中)兩種比例進(jìn)行連續(xù)傳代，選擇3代菌作為工作菌液。

1.2.1.2 活菌計(jì)數(shù)及pH值測(cè)定 以傳代后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)的時(shí)刻作為該代次菌株生命的零點(diǎn)，分別選擇3%濃度接種菌液的0、16、24、40、48 h以及10%濃度接種菌液的0、6、24、30、48 h這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，吸取菌液0.2 mL至1.8 mL支原體液體培養(yǎng)基中，以這種方式，10倍系列稀釋至10-6，選擇該稀釋度菌液，吸取0.1 mL滴至支原體固體培養(yǎng)基平皿表面，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的菌液進(jìn)行pH值測(cè)定，每種比例分別選取3個(gè)樣本。

1.2.1.3 生長曲線的繪制 取各時(shí)間點(diǎn)的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值，以時(shí)間為橫軸，分別以活菌濃度和pH值變化值為縱軸，繪制3%和10%傳代比例下的豬鼻支原體生長曲線和pH值變化曲線。

1.2.2 不同菌種代次差異比較

1.2.2.1 菌液制備 將豬鼻支原體凍干菌株啟開，用支原體液體培養(yǎng)基恢復(fù)原體積，10%比例接種至支原體液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，再按3%比例，將0.3 mL菌液加至9.7 mL支原體液體培養(yǎng)基中，以這種方式，連續(xù)傳至5代，分別選擇1～5代菌作為工作菌液。

1.2.2.2 活菌計(jì)數(shù)分別選擇1～5代菌菌液，各代次選取4個(gè)樣本，用“1.2.1.2”中所提及的方法，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并根據(jù)各處理重復(fù)數(shù)相等的方差分析方法[10]，對(duì)各代次間活菌濃度進(jìn)行差異分析。

1.2.3 不同傳代體積差異比較 將豬鼻支原體凍干菌株啟開，用1 mL支原體液體培養(yǎng)基恢復(fù)原體積，10%比例接種至支原體液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，再按3%比例，分別選擇兩種不同培養(yǎng)體積傳代，一種方式是將0.3 mL菌液加至9.7 mL支原體液體培養(yǎng)基中，另一種則是0.9 mL菌液加至29.1 mL培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，再以各自的方式傳至下一代，直至5代，隨機(jī)選擇兩種方式傳代的2～5代菌各20個(gè)樣本，用“1.2.1.2”中所提及的方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并用t檢驗(yàn)(雙樣本異方差檢驗(yàn))進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 不同接種濃度和收獲時(shí)間差異比較

2.1.1 不同接種濃度 活菌濃度和pH值的比較兩種濃度接種的豬鼻支原體各時(shí)間點(diǎn)的活菌濃度和pH值如表1和表2所示。從表1可以看出，3%濃度接種的豬鼻支原體0～48 h活菌濃度持續(xù)上升，到48 h達(dá)到峰值13.1×108CFU/mL，菌液pH值則持續(xù)下降，在40～48 h之間某時(shí)刻降至7.0以下。從表2可以看出，10%濃度接種的豬鼻支原體0～48 h活菌濃度持續(xù)上升，到48 h達(dá)到峰值14.0×108CFU/mL，菌液pH值則持續(xù)下降，在30～48 h之間某時(shí)刻降至7.0以下。

表1 3%濃度接種豬鼻支原體各時(shí)刻生長情況

表2 10%濃度接種豬鼻支原體各時(shí)刻生長情況

2.1.2 生長曲線 兩種接種濃度豬鼻支原體生長曲線見圖1和圖2。從圖1可以看出，以3%濃度接種，豬鼻支原體在0～48 h活菌濃度平穩(wěn)上升，生長速率逐漸升高。以10%濃度接種，豬鼻支原體在0～48 h活菌濃度持續(xù)上升，0～6 h為遲緩期，6～48 h為對(duì)數(shù)期，其中24～30 h生長速率最快。從圖2可以看出，0～48 h內(nèi)，兩種濃度接種菌液pH值變化范圍和趨勢(shì)大致相同，變化范圍為6.63～7.55。3%濃度接種，0～16 h內(nèi)，pH值下降平緩，16～48 h pH值下降速度較快。10%濃度接種，0～6 h內(nèi)，pH值下降平緩，6～48 h pH值下降速度較快，且10%比3% pH值下降更快。

圖1 不同接種比例豬鼻支原體生長曲線

圖2 不同接種比例豬鼻支原體pH值變化

2.2 1～5代菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見表3。各代次間活菌濃度進(jìn)行差異分析結(jié)果見表4，F(xiàn)=1.67

表3 1～5代菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

表4 1～5代菌活菌計(jì)數(shù)方差分析表

2.3 不同傳代體積差異比較 從表5可以看出兩種傳代體積豬鼻支原體不同生長情況，“0.3 mL菌液加入9.7 mL培養(yǎng)基”這種體積構(gòu)成的傳代方式下，20組菌液濃度平均值為24.4×108CFU/mL，標(biāo)準(zhǔn)差5.7；“0.9 mL菌液加入29.1 mL培養(yǎng)基”這種體積構(gòu)成的傳代方式下，20組菌液濃度平均值為7.2×108CFU/mL，標(biāo)準(zhǔn)差2.1；用雙樣本異方差假設(shè)下t檢驗(yàn)對(duì)這兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩種傳代方式下活菌濃度之間差異極顯著。

表5 不同傳代體積豬鼻支原體活菌濃度

**表示差異極顯著

3 討論與小結(jié)

本試驗(yàn)通過活菌計(jì)數(shù)和pH值測(cè)定，首次確定了豬鼻支原體適宜傳代比例、收獲時(shí)間、菌種代次以及傳代體積。

3.1 傳代比例 傳代比例是微生物傳代過程中一項(xiàng)重要的技術(shù)參數(shù)，劉軼秋等曾將3%作為支原體液體培養(yǎng)基質(zhì)控菌豬鼻支原體的傳代比例[9]，而在日常檢驗(yàn)中，常用的比例是10%，通過比較，10%接種傳代的菌，前期生長較快，而3%接種傳代的菌后期生長較快，兩種濃度傳代的菌濃度最后趨于統(tǒng)一。以3%比例傳代，豬鼻支原體初始數(shù)量相對(duì)較少，培養(yǎng)基體積相對(duì)較多，單位數(shù)量豬鼻支原體獲得的營養(yǎng)也更加豐富，更利于生長。另外，豬鼻支原體在培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)使pH值下降，而支原體這類微生物對(duì)生長環(huán)境的酸堿度有嚴(yán)格要求，pH值低于7的環(huán)境則會(huì)造成其生長抑制或死亡[2]，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在液體培養(yǎng)基中，pH改變和肺炎支原體生長有密切關(guān)聯(lián)，pH接近6時(shí)達(dá)到最大菌濃度，pH降至5.2時(shí)肺炎支原體迅速死亡[11]。在3%比例傳代下，菌液pH值下降相對(duì)較慢，以這種比例傳代，對(duì)豬鼻支原體的生長亦是一種保護(hù)，通過上述分析，較之10%，3%更適于作為培養(yǎng)基日常檢驗(yàn)中的傳代比例。

3.2 菌種最佳收獲時(shí)間 結(jié)合豬鼻支原體的生長曲線和pH值變化來看，豬鼻支原體傳代后16～48 h內(nèi)活菌濃度達(dá)(4.6～13.1)×108CFU/mL，在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)收獲菌液均可，但考慮到豬鼻支原體對(duì)低pH值的敏感性，故應(yīng)根據(jù)每次傳代接種情況的不同，在保證菌種充分生長的前提下，在菌液明顯變黃(pH<7)前收獲。

3.3 菌種代次 按照《中國獸藥典》二〇一〇年版規(guī)定支原體液體培養(yǎng)基質(zhì)控菌豬鼻支原體傳代不可超過5代[8]，故本次實(shí)驗(yàn)只對(duì)照1～5代菌。通過比較各代次菌在相同溫度下，培養(yǎng)相同時(shí)間后的活菌濃度，判斷出各代次菌之間生長差異。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析，1～5代菌活菌濃度之間無顯著差異，在培養(yǎng)基檢驗(yàn)工作中，為使培養(yǎng)基質(zhì)控菌均一、穩(wěn)定、活性強(qiáng)，可將1～5代菌作為質(zhì)控菌工作菌液。

3.4 傳代體積 豬鼻支原體兼性厭氧，且一般需要5%～10%CO2生長環(huán)境[2]，在封閉的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基和菌液混合體體積較小，氧氣二氧化碳等氣體體積相對(duì)較大，小體積培養(yǎng)相對(duì)于大體積培養(yǎng)，優(yōu)勢(shì)在于氣體更多。從本次試驗(yàn)結(jié)果來看，同為3%傳代比例下，“0.3 mL菌液+9.7 mL培養(yǎng)基”這種小體積的傳代方式比“0.9 mL菌液+29.1 mL培養(yǎng)基”這種大體積的傳代方式更利于豬鼻支原體生長，前者收獲時(shí)菌液濃度約為后者菌液濃度3倍，差異極顯著，說明在相對(duì)封閉的空間中，小體積培養(yǎng)模式更利于豬鼻支原體生長。通過上述分析可知，較之于“0.9 mL 菌液+29.1 mL 培養(yǎng)基”，將0.3 mL菌液加入9.7 mL培養(yǎng)基這種傳代方式更利于豬鼻支原體生長。

[1] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2007.

[2] 吳移謀, 葉元康.支原體學(xué)[M].北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2008.

[3] The United States Phamacopeial Convention,Inc.USP36NF31,General Chapter 63,Mycoplasma Tests[S].Rockville,MD,Volume 1,2013:67-71.

[4] 邵倩, 儲(chǔ)岳峰, 何生虎, 等.牛支原體生長曲線的測(cè)定和培養(yǎng)基篩選[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,51(3):549-551.

[5] 高珊, 逯忠新, 許立華.山羊支原體肺炎亞種培養(yǎng)基的篩選及生長曲線測(cè)定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,33(2): 17-20.

[6] 賈亞利, 潘展硯, 葉元康, 等.人型支原體的分離培養(yǎng)和生長特性的研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2007,22(2):142-145.

[7] 范媛. 牛支原體生長特性及其致病性研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2011.

[8] 中國獸藥典委員會(huì).中國人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部[S].

[9] 劉軼秋, 丁家波, 李蓓蓓, 等. 支原體檢驗(yàn)用培養(yǎng)基質(zhì)控菌株的生長曲線與世代時(shí)間測(cè)定[J]. 中國獸藥雜志, 2012, 46(12):13-15,18.

[10]謝莊, 賈青.獸醫(yī)統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].北京: 高等教育出版社, 2005.

[11]趙飛, 李晶, 陶曉霞, 等. 肺炎支原體液體培養(yǎng)中pH與活菌濃度的關(guān)系研究[J]. 中國病院生物學(xué)雜志, 2010, 5(11): 848-849.

(編 輯：李文平)

Study on the Generation and Growth Curve ofMycoplasmaCulture Medium Quality Control Strains

ZHU Zhen，WAN Jian-qing*，YANG Ting-ying，KANG Kai

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl，Beijing100081，China)

To research the growth characteristic ofMycoplasmahyorhinis，theMycoplasmaliquid and solid medium quality control strain, its growth conditions were compared under different generations and inoculation proportion with the index of pH and living cell concentration in the study. The results are followed: comparing passage concentration 3% and 10%,Mycoplasmastrains grew increasing and pH value continued to decline under two different concentration，but passage concentration 3% was more conducive toMycoplasmahyorhinisgrowth steady. There was no significant difference in the living strains concentration between 1～5 generations ofMycoplasma. By mixing 0.3 mL bacteria suspension and 9.7 mL medium, average bacteria concentration of 20 groups was (24.4±5.7)×108CFU/mL, by mixing 0.9 mL bacteria suspension and 29.1 mL medium, while the average value was (7.2±2.1)×108CFU/mL, two kinds of concentrations had a very significant difference and the former was more conductive to theMycoplasmagrowth. The text provided theory basis for the medium standardization work.

Mycoplasmahyorhinis；medium quality control；strains generation；growth curve

朱真，從事原材料質(zhì)控的檢測(cè)工作。

萬建青。 E-mail: wanjianqing@ivdc.org.cn

2015-03-29

A

1002-1280 (2015) 08-0010-05

R375