李倩，張玉潔，李丹，王鶴佳，仲鋒，徐秉恩

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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高效液相色譜法檢測多種動物組織中噁喹酸和氟甲喹殘留量的研究

李倩，張玉潔，李丹，王鶴佳，仲鋒*，徐秉恩

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

建立了豬、牛、羊的肌肉、脂肪、肝臟和腎臟四種組織中噁喹酸、氟甲喹殘留量檢測的高效液相色譜法。試樣經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液提取，C18固相萃取柱濃縮凈化，用高效液相色譜分析，熒光檢測器檢測，外標法定量。動物組織中噁喹酸和氟甲喹的檢測限為10 μg/kg，定量限為20 μg/kg。噁喹酸、氟甲喹在3～500 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。在20～300 μg/kg的濃度添加水平上，其平均回收率為63%～100%，批內(nèi)、批間的相對標準偏差均小于15%。

噁喹酸；氟甲喹；殘留；動物組織；高效液相色譜法

噁喹酸和氟甲喹屬于第二代喹諾酮類抗菌藥物，作用機理主要是抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位，破壞它的活性，使脫氧核糖核酸、核糖核酸及蛋白質(zhì)的合成受干擾，細胞不能再進行分裂，從而起到殺菌作用[1]。本類藥物一般毒性較低，安全范圍大[2]，但是，隨著噁喹酸和氟甲喹在獸醫(yī)臨床上的廣泛應用，違規(guī)使用可導致動物性產(chǎn)品中藥物殘留超標，對食用者造成危害[3]。農(nóng)業(yè)部第235 號公告[4]對噁喹酸和氟甲喹在多種動物組織中的最高殘留限量( MRL) 進行了規(guī)定?，F(xiàn)在所用標準農(nóng)業(yè)部第236號公告[5]《動物性食品中噁喹酸和氟甲喹殘留檢測方法(雞)—高效液相色譜法》在檢測動物品種及動物組織覆蓋面上均不能滿足實際檢測的要求。因此，為使檢測方法更加簡便、易于操作，同時增加檢測的動物品種及組織，更好地滿足實際檢測工作的需求，本研究在上述檢測方法的基礎上做了進一步改進，建立了噁喹酸、氟甲喹在豬、牛、羊的肌肉、脂肪、肝臟和腎臟四種組織中的殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和設備 Agilent1100 高效液相色譜儀(配熒光檢測器和二元梯度洗脫系統(tǒng))；C18色譜柱: 250 mm×4.6 mm (i.d)，粒徑5 μm；SPE柱:Bond Elut C18固相萃取柱(200 mg/3 mL)；微孔濾膜：0.45 μm；分析天平：感量0.00001 g；天平：感量0.01 g；組織勻漿機；渦旋混合儀；振蕩器；高速離心機。

1.2 試劑和溶液噁喹酸標準品 (含量≥98.0%，DrEhrenstorfer GmbH，批號：C15788000)；氟甲喹標準品(含量≥99.0%，浙江仙居捷大醫(yī)藥，批號：2011323)；氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸均為分析純；甲醇、四氫呋喃、乙腈均為色譜純；水為去離子水。1mg /mL噁喹酸和氟甲喹標準儲備液，噁喹酸和氟甲喹標準工作液，5.0 mol/L氫氧化鈉溶液，0.03 mol/L氫氧化鈉溶液，磷酸鹽緩沖溶液，0.02 mol/L磷酸溶液。

1.3 色譜條件 流動相：0.02 mol/L磷酸溶液-乙腈-四氫呋喃(68∶16∶16)；檢測波長：激發(fā)波長325 nm，發(fā)射波長369 nm。柱溫30℃。流速0.8 mL/min。進樣量20 μL。

1.4 標準曲線的繪制精密量 取適量噁喹酸和氟甲喹標準工作液，用流動相稀釋成濃度為3，10，50，100，300，500 ng/mL的系列溶液。

1.5 樣品的提取和凈化提取 稱取(2±0.05)g試料，置50 mL離心管中，加磷酸鹽緩沖溶液10.0 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min。15000 r/min離心10 min，取上清液于另一50 mL離心管中。殘渣中再加磷酸鹽緩沖溶液10.0 mL；重復提取一遍。合并兩次上清液，渦旋混勻。15000 r/min離心10 min，取上清液備用。凈化：固相萃取柱依次用甲醇、水各2 mL預洗。取備用液6.0 mL過柱，水2 mL淋洗，擠干。用流動相2.0 mL洗脫，擠干，收集洗脫液。經(jīng)濾膜過濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的測定準確量 取適量標準工作液，用流動相稀釋成3～500 ng/mL的對照溶液，供高效液相色譜分析。以各色譜峰峰面積為縱坐標，對照溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線(圖1)。標準曲線方程分別為噁喹酸y=0.0504x-0.0943，相關(guān)系數(shù)r=0.9992；氟甲喹y=0.0602x-0.1549，相關(guān)系數(shù)r=0.9991。

2.2 方法精密度和準確度 采用標準添加法，在空白組織中添適量標準溶液，制成含噁喹酸和氟甲喹濃度為20～300 μg/kg的添加樣品進行回收率測定，每個濃度設定5個平行樣品，同時進行空白試驗，重復3次，求每個樣品的回收率和批內(nèi)、批間相對標準偏差(RSD)。噁喹酸和氟甲喹標準、空白豬肝臟及添加色譜圖如圖2所示。本實驗中所用空白組織均為實驗室無添加飼養(yǎng)并經(jīng)檢測的不含有待測組分的空白樣品。結(jié)果表明，噁喹酸和氟甲喹在20、100、300 μg/kg添加水平的平均回收率在63%～100%之間。批內(nèi)相對標準偏差<12%，批間相對標準偏差<15%，結(jié)果表明，重復性好，回收率高，方法的準確度和精密度可以滿足殘留檢測的要求(表1)。

2.3 方法靈敏度空白試料 按1.5項下提取凈化方法處理后進行色譜分析，在相應的保留時間處，空白試料對所測分析物無干擾。在豬、牛、羊三種動物的各肌肉、脂肪、肝臟、腎臟四種組織中添加標準溶液，使其在組織中的添加濃度分別為5、10、20 μg/kg。按照1.5項下提取凈化方法處理后，經(jīng)HPLC檢測。測定結(jié)果顯示，添加濃度為10 μg/kg時，藥物的信噪比(S/N)約等于3，添加濃度為20 μg/kg時，信噪比均>10，因此，確定噁喹酸、氟甲喹在豬、牛、羊三種動物的各肌肉、脂肪、肝臟、腎臟四種組織中的檢測限為10 μg/kg，定量限為20 μg/kg。

圖1 噁喹酸、氟甲喹標準曲線圖

圖2 噁喹酸和氟甲喹標準、空白豬肝及添加色譜圖

3 討論與小結(jié)

3.1 提取條件的優(yōu)化 農(nóng)業(yè)部第236號公告《動物性食品中噁喹酸和氟甲喹殘留檢測方法(雞)—高效液相色譜法》中用兩種不同的提取液對雞組織進行提取，分別是pH 7.0的磷酸鹽緩沖液用于雞肌肉、脂肪；pH 4.0～5.0磷酸鹽溶液用于雞肝臟、腎臟。經(jīng)過對兩種提取液的考察，本方法僅采用pH 7.0磷酸鹽緩沖液為提取液，即可滿足對不同動物組織的提取，使方法的操作更為簡單快捷。236號公告方法采用4000 r/min離心取上清液，由于離心速度慢，上清液比較渾濁，容易造成后續(xù)過固相萃取柱時柱子堵塞。本方法提高離心轉(zhuǎn)速至15000 r/min，上清液清透，過柱容易。

3.2 凈化條件的優(yōu)化 236號公告方法采用取10.0 mL提取液過100 mg/ mLC18固相萃取柱進行凈化，2.0 mL流動相洗脫，由于固相萃取柱體積小，過柱溶液量大，往往容易造成柱子堵塞，使實驗無法進行。經(jīng)過反復實驗，本方法采用取6.0 mL提取液過200 mg/3mL C18固相萃取柱進行凈化，2.0 mL流動相洗脫。不僅柱容量更加，過柱的提取液也減少，柱子不會堵塞，而且縮短了實驗的時間。

3.3 穩(wěn)定性考察 本研究同時還首次對噁喹酸和氟甲喹的標準儲備液、標準工作液、標準對照液進行穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明，置2～8℃冰箱中保存，在3個月的時間內(nèi)，穩(wěn)定性良好。

本研究采用高效液相色譜熒光檢測器檢測，建立了噁喹酸、氟甲喹在豬、牛、羊的肌肉、脂肪、肝臟和腎臟四種組織中的殘留檢測方法。該方法操作簡單，靈敏度高，準確度和精密度好，動物組織覆蓋范圍廣，可以很好地滿足實際檢測工作的需要。

[1] 李劍勇，魯潤華.動物用氟喹諾酮類藥物的研究進展概況[J]．中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2004，6：19-23.

[2] 李倩，張玉潔，王鶴佳，等.噁喹酸、氟甲喹在雞蛋和牛奶中殘留量的檢測方法研究[J].中國獸藥雜志，2012，46(8): 20-23.

[3] 吳超程，林麗，張素霞，等.高效液相色譜法測定雞飼料中噁喹酸喹酸的含量[J].中國飼料，2013，4：36-38.

[4] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．公告第235 號—動物性食品中獸藥最高殘留限量[S]．

[5] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．公告第236 號—動物性食品中噁喹酸和氟甲喹殘留檢測方法(雞)—高效液相色譜法[S]．

(編 輯：侯向輝)

Determination of Oxolinic Acid and Flumequine in Tissues of Several Animals by HPLC

LI Qian，ZHANG Yu-jie LI Dan，WANG He-jia，ZHONG Feng*，XU Bing-en

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugsControl，Beijing100081，China)

An HPLC method for the determination of oxolinic acid and flumequine in muscle，fat，liver and kidney of swine，cattle and sheep has been developed.The sample residues were extracted by phosphate solution，purifid with C18 solid phase extraction column，seperated by HPLC with a fluorescence detector and quanlified by external standard calibration curves.The limit of detection was 10 μg/kg foroxolinic acid and flumequine，with quantification limit of 20 μg/kg.A good linearity of the calibration curves for oxolinic acid and flumequine was obtained within the range of 3～500 ng/mL.The average recoveries at level of 20～300 μg/kg were 63%～100%.The intra-and-interbatch variation coefficients were both less than 15%.

oxolinic acid；flumequine；residues；animal tissue；HPLC

李倩，碩士，從事獸藥科研管理及殘留檢測工作。

仲鋒。E-mail：zhongfeng@ivdc.org.cn

2015-04-30

A

1002-1280 (2015) 08-0035-04

S859.84