黎雪清 魯藝 王鐵杰 殷果 韓東岐 江坤

廣東省深圳市藥品檢驗(yàn)所深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518057

抗風(fēng)濕類(lèi)中成藥和保健食品中非法添加化學(xué)成分的高液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測(cè)

黎雪清 魯藝 王鐵杰 殷果 韓東岐 江坤

廣東省深圳市藥品檢驗(yàn)所深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518057

目的建立一種快速檢測(cè)抗風(fēng)濕類(lèi)中成藥和保健食品中30種非法添加化學(xué)成分的高液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。方法色譜條件:C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，質(zhì)譜條件:電噴霧離子化正離子檢測(cè)(ESI+)，全掃描一級(jí)質(zhì)譜、選擇離子二級(jí)掃描質(zhì)譜檢測(cè)方式，掃描范圍50～800 aum，對(duì)抗風(fēng)濕類(lèi)中成藥和保健食品中非法添加的化學(xué)成分進(jìn)行快速定性分析。結(jié)果根據(jù)檢測(cè)到的化合物的色譜保留時(shí)間及一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，并與對(duì)照品比較，可作為分析抗風(fēng)濕類(lèi)中成藥和保健食品中非法添加嗎啡、甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚、羅通定、氨基比林、龍膽苦苷、磺胺甲惡哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、鹽酸美沙酮、潑尼松、可的松、異丙安替比林、吡羅昔康、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和丙酸倍氯米松等30種化學(xué)成分的有效手段。在50批供試品中，檢測(cè)到有10種供試品中含有非法添加的化學(xué)成分。結(jié)論本方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高，可作為抗風(fēng)濕類(lèi)中成藥和保健食品中非法添加化學(xué)成分的快速檢測(cè)方法。

液質(zhì)聯(lián)用法;快速檢測(cè);抗風(fēng)濕類(lèi);非法添加

我國(guó)地理緯度跨度大，高寒、高濕地區(qū)多，導(dǎo)致我國(guó)具有較高的風(fēng)濕病發(fā)病率［1］。風(fēng)濕性及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以疼痛、麻木、關(guān)節(jié)活動(dòng)不靈為主要癥狀，是一種致殘性非常強(qiáng)的疾?。?-3］?；谏鲜銮闆r，不法商家為牟取暴利，突顯產(chǎn)品療效，在抗風(fēng)濕類(lèi)中成藥和保健食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)［4-5］，使通常起效慢的中藥和保健食品似乎具備了速效、高效的優(yōu)點(diǎn)。在健康產(chǎn)品中非法添加的化學(xué)藥物，未經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證、臨床驗(yàn)證和國(guó)家相關(guān)部門(mén)嚴(yán)格審核批準(zhǔn)，本身質(zhì)量安全難以控制保證，而且存在隨意性和不確定性。這種非法現(xiàn)象會(huì)給社會(huì)和消費(fèi)者帶來(lái)了嚴(yán)重的，甚至導(dǎo)致死亡的威脅，同時(shí)引起了國(guó)家相關(guān)監(jiān)管部門(mén)的重視。建立完善的檢測(cè)非法添加化學(xué)藥物的專(zhuān)屬性方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。由于中成藥和保健食品添加的化學(xué)成分種類(lèi)繁多、基體復(fù)雜，對(duì)分析儀器的檢測(cè)能力要求苛刻，現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)是目前眾多分析化學(xué)方法中同時(shí)具備了靈敏度高、特異性好、普適性強(qiáng)、高通量等優(yōu)點(diǎn)的分析方法，可對(duì)多組分混合物定性鑒定和分子結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確判定［6-8］。

高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜(LCMS-IT-TOF)在現(xiàn)有各廠家質(zhì)譜儀不能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多級(jí)質(zhì)譜功能和精確質(zhì)量測(cè)定的行業(yè)現(xiàn)狀下，實(shí)現(xiàn)了離子阱質(zhì)譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜的完美結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)既可以做多級(jí)質(zhì)譜，又能達(dá)到高質(zhì)量精度的強(qiáng)大功能。充分利用IT-TOF獲得的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在一級(jí)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)的候選物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)多級(jí)質(zhì)譜的數(shù)據(jù)對(duì)比，確認(rèn)真正的物質(zhì)，使成分鑒定更準(zhǔn)確，離子信息更豐富。

本研究以國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件“抗風(fēng)濕類(lèi)中成藥”(批準(zhǔn)件編號(hào)2009025)［9］為基礎(chǔ)，結(jié)合市場(chǎng)上新發(fā)現(xiàn)的非法添加化學(xué)成分情況，采用LCMS-TI-TOF對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定性分析，獲得高準(zhǔn)確度、高分辨率、高靈敏度的多級(jí)質(zhì)譜信息，準(zhǔn)確快速驗(yàn)證非法添加的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，建立了快速檢測(cè)抗風(fēng)濕類(lèi)中成藥和保健食品中嗎啡、甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚、羅通定、氨基比林、龍膽苦苷、磺胺甲嗯哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、鹽酸美沙酮、潑尼松、可的松、異丙安替比林、吡羅昔康、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和丙酸倍氯米松等30種非法添加化學(xué)成分的液質(zhì)聯(lián)用方法［10-14］，進(jìn)一步為打擊藥品和保健食品制假售假工作提供了有效的手段［15］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LCMS-IT-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津公司，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，電噴霧離子源(ESI)，LCMSolution色譜工作站);XS105DU十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒公司);Milli-Q Academic純水器(美國(guó)MILLIPORE公司);SB25-12DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

氨基比林(批號(hào):100503-200301)、嗎啡(批號(hào): 171201-201324，含量99.1%)、甲氧芐啶(批號(hào):10031-200304)、對(duì)乙酰氨基酚(批號(hào):100018-200408)、羅通定(批號(hào):100452-200301)、龍膽苦苷(批號(hào):200106)、磺胺甲嗯哇(批號(hào):100025-200904，含量99.8%)、安替比林(批號(hào):100506-200301)、阿司匹林(批號(hào): 100113-201104)、鹽酸美沙酮(批號(hào):171243-200602)、潑尼松(批號(hào):100199-201002，含量98.5%)、可的松(批號(hào):101128-201001，含量97.2%)、異丙安替比林(批號(hào):100525-200301)、吡羅昔康(批號(hào):100177-200603，含量99.8%)、氫化可的松(批號(hào):100152-200206)、金諾芬(批號(hào):100272-201202)、地塞米松(批號(hào):100129-200804，含量99.6%)、醋酸曲安奈德(批號(hào):100125-201105，含量97.8%)酮洛芬(批號(hào): 100337-200502)、萘普生(批號(hào):100198-200403)、地西洋(批號(hào):171225-200903，含量99.9%)、醋酸地塞米松(批號(hào):100122-201206)、保泰松(批號(hào):100481-200601，含量99.9%)、奧沙普秦(批號(hào):100353-200301)、雙氯芬酸鈉(批號(hào):100334-200302)、丙酸倍氯米松(批號(hào):100119-200603)對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;非那西丁(批號(hào):81105，含量98.5%，德國(guó)DR.EHRENSTORFER)、甲基潑尼松龍(批號(hào):20100402，EDQM)、舒林酸(批號(hào):10J345，含量99.8%，USP)、吲哚美辛(批號(hào):01105，含量99.0%，德國(guó)DR.EHRENSTORFER);甲醇和乙酸均為色譜純;水為超純水(自制)。待測(cè)樣品均為市售。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

CAPCELLPAKC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇(A)和0.1%乙酸溶液(B)，梯度洗脫:0～5min，40%～50%A;5～25 min，55%～60%A;25～40 min，70%～75%A;40～45 min，90%A。柱溫:35℃;樣品室溫度: 20℃;進(jìn)樣量:10 μL;體積流量:1.0 mL/min(分流比為1∶5)。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜裝配電噴霧電離源(ESI);m/z 50～800 amu;噴霧氣流:1.5 L/min;曲型脫溶劑管(CDL)溫度:200℃;加熱板溫度:200℃;檢測(cè)電壓:1.65 kV;干燥氣(N2)電壓:112 kPa;碰撞能量范圍:20%～70%;正離子模式檢測(cè)。掃描方式采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜、選擇離子二級(jí)掃描質(zhì)譜監(jiān)測(cè)(MS/MS)。

2.3 對(duì)照品溶液的配制

取各對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1毫升中各含嗎啡、甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚、羅通定、氨基比林、龍膽苦苷、磺胺甲惡哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、鹽酸美沙酮、潑尼松、可的松、異丙安替比林、吡羅昔康、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和丙酸倍氯米松0.1 mg的混合對(duì)照品貯備液;精密量取上述貯備液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 供試品溶液的配制

取供試品(相當(dāng)于一次口服劑量)研細(xì)，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取上清液適量加甲醇稀釋100倍，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.5 質(zhì)譜特征

取混合對(duì)照品溶液，按上述質(zhì)譜條件檢測(cè)。部分化學(xué)成分不能達(dá)到完全分離，但因各待測(cè)成分的準(zhǔn)分子離子峰不同，通過(guò)質(zhì)譜的高靈敏和高選擇測(cè)定，不會(huì)造成相互間的干擾。記錄全掃描一級(jí)質(zhì)譜、選擇離子二級(jí)質(zhì)譜信息。30種化學(xué)成分的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.6 樣品測(cè)定

按“2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，在上述色譜和質(zhì)譜條件下測(cè)定，共測(cè)50批樣品，其中包括中成藥24批，保健食品26批。測(cè)得樣品呈陽(yáng)性的結(jié)果見(jiàn)表2。部分對(duì)照品及供試品的一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

3 討論

3.1 液質(zhì)聯(lián)用法優(yōu)勢(shì)

中成藥和保健食品添加的化藥成分種類(lèi)繁多、基體復(fù)雜［16］，采用化學(xué)方法或者高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;通過(guò)一級(jí)全掃描模式可獲得化合物的準(zhǔn)分子離子峰，但若遇復(fù)雜的基質(zhì)，同樣容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，因此需提取該分子離子為母離子進(jìn)行二級(jí)掃描獲得碎片信息。本文采用液質(zhì)聯(lián)用法，基于LCMS-IF-TOF譜，對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定性分析，獲得高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高分辨率和高靈敏度的多級(jí)質(zhì)譜LCMS-IT-TOF信息，準(zhǔn)確快速驗(yàn)證非法添加的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)。通過(guò)比較對(duì)照品及供試品的保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰及二級(jí)質(zhì)譜碎片等信息，對(duì)供試品進(jìn)行結(jié)果確證，提高檢測(cè)的專(zhuān)屬性。

3.2 檢測(cè)模式選擇

由于待測(cè)成分繁多，為了全面快速驗(yàn)證多種化學(xué)成分，利用離子阱(IT)和飛行時(shí)間(TOF)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可以完成MS1的正離子模式和負(fù)離子模式的自動(dòng)切換并掃描，并可以進(jìn)行MSn的正離子模式和負(fù)離子模式的相互之間切換并掃描。盡管相互切換的時(shí)間很短，但正離子模式和負(fù)離子模式下的高質(zhì)量準(zhǔn)確度仍然是可以確保的。故本研究采用同時(shí)對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行正負(fù)離子模式檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測(cè)成分中安替比林和非那西丁由于存在酰胺鍵(-CO-NH)在負(fù)離子檢測(cè)模式(ESI-)下響應(yīng)較差，且適合負(fù)離子檢測(cè)的成分在正離子模式(ESI+)下響應(yīng)較好，待測(cè)成分均易加氫或者加鈉形成正電荷離子峰。因此，本法最終采用ESI+同時(shí)檢測(cè)30種待測(cè)成分，大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，提高檢驗(yàn)效率。

3.3 測(cè)定結(jié)果

隨著科技的進(jìn)步，單一化學(xué)成分的效果有時(shí)沒(méi)有多種成分的合理組合更有利于調(diào)整人的生理功能，更利于改善產(chǎn)品的質(zhì)量特征。通過(guò)測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)，造假分子也會(huì)“與時(shí)俱進(jìn)”把化學(xué)藥品中的組合應(yīng)用行為轉(zhuǎn)移到中成藥、保健食品中，從非法添加單一成分轉(zhuǎn)向非法添加組合成分［15］。本研究發(fā)現(xiàn)添加的化學(xué)藥成分多屬于處方藥，服用時(shí)有嚴(yán)格的適應(yīng)證、禁忌證，需要在醫(yī)生指導(dǎo)下才能安全有效使用?；颊咴诓恢榈那闆r下使用，輕則耽誤治療時(shí)機(jī)，加重治療成本，重則過(guò)量服用藥物，引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡。非法添加化學(xué)藥成分的客觀事實(shí)已經(jīng)對(duì)公眾生命財(cái)產(chǎn)安全形成威脅、造成危害。本方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，有效地同時(shí)檢測(cè)抗風(fēng)濕類(lèi)中成藥和保健食品非法添加的多種化學(xué)成分，為檢測(cè)和打擊非法添加行為提供更全面、更有力的技術(shù)支撐，提高監(jiān)督檢驗(yàn)效率。

筆者還運(yùn)用上述色譜系統(tǒng)建立了一種在45 min內(nèi)快速篩查嗎啡、甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚嗎啡、甲氧芐啶、對(duì)乙酰氨基酚、龍膽苦苷、磺胺甲惡哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、潑尼松、異丙安替比林、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、丙酸倍氯米松等24種抗風(fēng)濕類(lèi)化學(xué)成分的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器快速篩查方法以便監(jiān)督檢驗(yàn)。

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Rapid determination of chemicals added illegally in anti-rheumatic traditional Chinese medicines and health products by HPLC-MS/MS

LI XueqingLU YiWANG TiejieYIN GuoHAN DongqiJIANG KunShenzhen Institute for Drug ControlShenzhen Key Laboratory of Drug Quality Standard Research，Guangdong Province，Shenzhen518057，China

Objective To establish an HPLC-MS/MS method for rapid determination of 30 chemicals added illegally in anti-rheumatic traditional Chinese medicines and health products.Methods The HPLC chromatographic determination was condcted on C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm).The gradient elution was done with the mixed solution of methanol-0.1%acetic acid.The mass spectrometer condition was as follows:the ionition mode was ESI+，the mode was mass scan and daughter scan with scan range from 50 to 800 aum，and the chemicals in sample were rapid screended and identified.Results Chemicals added illegally，ncluding Morphine，Trimethoprim，Paracetamol，Rotundine，Aminopyrine，Gentiopicroside，Sulfamethoxazole，Phenazone，Aspirin，Phenacetin，Methadone hydrochloride，Prednisone，Cortisone，Propyphenazone，Piroxicam，Hydrocortisone，Auranofin，Dexamethasone，Methylprednisolone，Triamcinolone acetonide acetate，Ketoprofen，Sulindac，Naproxen，Diazepam，Dexamethasone acetate，Phenylbutazone，Oxaprozin，Diclofenac sodium，Indomethacin and Beclomethasone dipropionate，were identified according to the spectrum，chromatogramphic behavior and mass spectral data by comparison with those of reference substances.Chemicals added illegally were detected in 10 samples from 50 samples.Conclusion The method is sufficiently selective，sensitive and can be employed in the rapid determination of chemicals added illegally in anti-rheumatic traditional Chinese medicines and health products.

HPLC-MS/MS；Rapid determination；Anti-rheumatic；Illegally addition

R917

A

1673-7210(2015)02(c)-0086-05

2014-11-25本文編輯:衛(wèi)柯)

廣東省深圳市基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(編號(hào)JCYJ20120618 153944322)。

黎雪清(1987.1-)，女，碩士研究生;研究方向:藥物質(zhì)量分析與標(biāo)準(zhǔn)研究。