李珊珊，王琳琳，呂 巍，楊樹法，于 璐

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院遺傳代謝實驗室 100026)

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·論 著·

健康漢族孕婦GJB2基因突變產(chǎn)前篩查分析

李珊珊，王琳琳，呂 巍，楊樹法，于 璐

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院遺傳代謝實驗室 100026)

目的 確定健康漢族孕婦的GJB2基因突變產(chǎn)前篩查。方法 對475例研究對象基因組DNA提取，聚合酶鏈反應(yīng)擴增，基因芯片檢測GJB2、GJB3、SLC26A4及線粒體12S rRNA 4個基因9個位點；直接測序檢測其GJB2突變譜情況。結(jié)果 利用耳聾基因芯片，檢出15例研究對象攜帶6種致病突變，包括14例雜合突變：GJB2基因檢出3個框移突變，176-191 del 16、235del C和299-300del AT，35del G未檢出；SLC26A4基因檢出2個錯義突變，2168A>G 和IVS7-2A>G；檢出1例線粒體12S rRNA 1555A>G純合型突變。直接測序法檢測整個GJB2編碼區(qū)，檢出176-191del 16、235del C、299-300del AT、109G>A 4種致病突變；79G>A、341A>G、478A>G和608T>C 4種多態(tài)性；11G>A、187G>T、372G>A、558G>A 4種未分類突變。其中211例研究對象至少攜帶1種GJB2突變，占檢測總數(shù)的44.4%。結(jié)論 該研究有助于孕婦產(chǎn)前耳聾基因突變的篩查分析，輔助孕婦遺傳性聽力損失的遺傳咨詢。

突變頻率； GJB2基因突變； 遺傳性耳聾

聽力障礙是一種常見的疾病，發(fā)生率1∶1 000，多方面原因可造成耳聾，其中50%～60%與遺傳因素有關(guān)[1]。70%遺傳性耳聾被認為是非綜合征性耳聾(NSHI)，特點是只有聽力損失，不伴有其他臨床癥狀[2]。NSHI具有高度的遺傳異質(zhì)性，國內(nèi)外學(xué)者對其進行了較深入研究，不斷地定位新的耳聾基因位點和克隆新的耳聾基因。GJB2基因是最常見的NSHI突變基因，主要引起先天性重度、極重度感音神經(jīng)性耳聾[2]。本研究通過對475例健康孕婦GJB2基因進行產(chǎn)前篩查，初步分析健康孕婦人群耳聾基因突變情況，并報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 475例血標本均來自2012年12月至2013年5月本院門診健康孕婦；年齡19～40歲，平均30.2歲；漢族。標準調(diào)查問卷自我測評均無聽力損失。標本2～8 ℃保存。

1.2 儀器與試劑 全血DNA提取試劑盒(天根生物)，遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒(博奧生物有限公司)；PCR儀(博日公司)；芯片雜交儀、芯片掃描儀、芯片洗干儀(博奧生物有限公司)；ABI 3100 DNA測序儀(PE公司)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取 取EDTA抗凝靜脈血0.5 mL，按試劑盒說明書進行全血DNA提取，DNA標本-20 ℃保存。

1.3.2 耳聾基因芯片檢測 按照遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒說明書，檢測研究對象的耳聾基因GJB2(35del G、176-191del 16、235del C和299-300del AT)，GJB3(538C>T)，線粒體DNA 12S rRNA(1494C>T、1555A>G)，SLC26A4(2168A>G和IVS7-2A>G)突變情況。

1.3.3 直接測序檢測 根據(jù)Genebank中標準GJB2序列(NM_004004)，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計測序引物，上游引物：5′-TGC TTG CTT ACC CAG ACT-3′，下游引物：5′-GGT TGC CTC ATC CCT CTC-3′。PCR擴增反應(yīng)體系為10 μL，體系中含有：100 ng基因組DNA，2.5 μL PCR緩沖液，1.25 mM MgCl2，1 mM dNTP，每個引物10 pmol，1 U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件：37 ℃ 10 min，95 ℃預(yù)變性5 min，后以95 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s和72 ℃延伸30 s，以此重復(fù)33個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。應(yīng)用ABI3100 DNA測序儀，利用以上引物進行正反向雙向測序。應(yīng)用NCBI BLAST比對。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 95%可信區(qū)間比較本研究中檢測出的突變頻率與其他亞洲人群突變頻率的差異。

2 結(jié) 果

2.1 GJB2基因突變結(jié)果 采用耳聾基因芯片檢測技術(shù)檢出11例GJB2基因突變，包括1例176-191del 16，6例235del C，4例299-300del AT突變；35del G未檢出，見表1。475例標本中有211例檢出至少攜帶一種突變位點，突變頻率44.4%。檢出的4種致病突變中，除109G>A突變外，測序均與耳聾基因芯片檢測結(jié)果一致。此外，通過測序技術(shù)檢出79G>A、341A>G、478A>G和608T>C 4種非致病性多態(tài)；79G>A和341A>G在本研究中等位基因頻率分別為25.68%和19.89%，是最常見的突變位點，見表2。對健康孕婦GJB2基因第2外顯子直接測序，檢出12個突變位點，包括4個致病突變(109G>A、176-191del 16、235del C、299-300del AT)，4個多態(tài)性位點(79G>A、341A>G、478A>G、608T>C)，4個未分類突變位點(11G>A、187G>T、372G>A、558G>A)，見表3。11G>A、372G>A、558G>A和187G>T突變與遺傳性耳聾的相關(guān)性尚未明確，558G>A檢出2例，等位基因頻率0.42%。此外，299-300del AT突變位點在本研究中的突變頻率為0.42%。通過測序檢出在相同的等位基因同時出現(xiàn)一種或多種雜合突變，如[79G>A /wt]、[109G>A/341A>G]和[(79G>A+109G>A+341A>G)/wt]；在相同的等位基因同時出現(xiàn)純合、雜合突變，如[11G>A/11G>A]+[79G>A/341A>G]、[79G>A /79G>A]+[341A>G/wt]和[341A>G/341A>G]+[79G>A/wt]。

表1 475例健康孕婦GJB2基因突變耳聾基因芯片檢測結(jié)果分析

表2 GJB2基因突變直接測序檢測基因型結(jié)果分析

續(xù)表2 GJB2基因突變直接測序檢測基因型結(jié)果分析

注：*wt表示野生型。

表3 475例健康孕婦GJB2基因突變直接測序檢測結(jié)果分析

續(xù)表3 475例健康孕婦GJB2基因突變直接測序檢測結(jié)果分析

注：109G>A為致病性存在爭議；187G>T為有研究表明錯義突變。

2.2 GJB3、線粒體12S rRNA和SLC26A4突變結(jié)果 GJB3基因538C>T、線粒體12S rRNA基因1494C>T突變位點未檢出，見表3。檢出1例線粒體12S rRNA基因1555A>G純合突變；1例SLC26A4基因2168A>G/雜合突變，2例IVS7-2A>G雜合突變，突變頻率分別為0.11%和0.21%。檢出2例樣本同時帶有GJB2和SLC26A4基因的位點突變，分別為：2168A>G/wt+79G>A/79G>A+341A>G/341A>G和 IVS7-2A>G/wt+79G>A/79G>A+341A>G/341A>G。

2.3 GJB2基因235del C在不同研究中的突變頻率 本研究235del C突變頻率為1.26%(95%CI,0.46～2.73)，與不同東亞國家健康人群中的235del C突變頻率相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 235del C突變在不同東亞國家健康人群中的突變頻率比較

3 討 論

遺傳性NSHI有高度的遺傳異質(zhì)性，本研究利用基因芯片對475例健康漢族孕婦遺傳性耳聾基因進行產(chǎn)前篩查，檢出6.3%攜帶有GJB2基因突變，0.8%檢出帶有線粒體12S rRNA和SLC26A4基因突變，GJB3基因的538C>T基因突變未檢出。通過直接測序，475例孕婦中有211例檢測出至少攜帶一種GJB2致病突變和(或)多態(tài)，占44.4%。其中235del C雜合型突變9例，突變頻率1.26%，類似于韓國人群(1.11%)，但高于泰國人群(0.49%)，低于日本人群(1.65%)和中國臺灣人群(2.08%)，235del C突變頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。299-300del T突變主要發(fā)生在東亞地區(qū)[3,5]，其他地區(qū)突變頻率未見報道。本研究檢出4例299-300del AT雜合型突變，突變頻率為0.84%。檢出1例176-191del 16突變，且為雜合型突變，突變頻率0.21%。

等位基因109G>A與遺傳性NSHI的相關(guān)性一直存在爭議。Kelly在1998年首次報道109G>A為NSHI的基因多態(tài)性，僅在健康人群中檢出，突變頻率為0.5%[12]。后續(xù)報道109G>A作為一種致病突變以純合和(或)雜合突變的形式存在，在健康人群中沒有檢出或其檢出的突變頻率低于耳聾患者的突變頻率[13-14]。對東亞人群研究發(fā)現(xiàn)，109G>A與輕、中度聽力損失相關(guān)；在中國、韓國、泰國的中度聽力損失患者中檢出高于健康對照組[15-16]。本研究109G>A等位基因突變頻率為2.95%(28/950)，10例為雜合型突變，9例為純合型突變，19例均未檢出與其他突變類型結(jié)合的復(fù)合雜合突變。與部分文獻報道相矛盾，分析原因有以下幾點：第一，研究對象選擇存在偏倚，以往研究對照組中未包含109G>A純合型的正常聽力者；第二，109G>A突變引起的中度聽力損傷相對起病晚、病程進程慢,而且109G>A突變引起的聽力損傷的病理癥狀可能由其他基因或環(huán)境因素調(diào)控[14,17-18]；本研究中，109G>A純合型的研究對象還未表現(xiàn)出聽力損傷的癥狀；第三，109G>A突變可能不是致病基因位點，與GJB2或其他基因上的等位基因發(fā)生連鎖不平衡作用，作者所觀察的耳聾臨床癥狀是109G>A突變跟隨著其他等位基因作用造成的，將在后續(xù)進一步追蹤研究對象的聽力情況。

79G>A、341A>G、478A>G和608T>C在本研究中均有檢出，79G>A、341A>G等位基因頻率分別為25.68%、19.89%，是最普遍的多態(tài)類型；檢出136例79G>A、341A>G純合/雜合突變，占28.6%。79G>A、341A>G彼此相關(guān)，易在同一個體中同時出現(xiàn)，而且一些功能研究發(fā)現(xiàn)，攜帶此突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細胞，由于縫隙連接蛋白障礙而導(dǎo)致鈣離子轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙[16]。研究中還檢出11G>A、187G>T、372G>A、558G>A 4種未分類突變。11G>A在亞洲人群、非洲裔美國人群中突變頻率較低，與本研究等位基因突變頻率(2/950，0.21%)結(jié)果相似[18]。而以往研究中僅在耳聾患者檢出187G>T突變，有學(xué)者認為更可能為致病性突變而不是非致病性多態(tài)[10]。以上多態(tài)性及未分類突變是否與遺傳性耳聾相關(guān)，還需要進一步研究驗證。

通過GJB2基因的直接測序，發(fā)現(xiàn)研究人群中109G>A突變、235del C突變和299-300del AT突變頻率分別為5.90%、1.26%和0.84%，是GJB2基因中較為普遍的致病突變類型。以往研究中學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在中國人群GJB2基因中，235del C突變和299-300del AT突變是突變率比較高的類型之一[10]。在健康人群中產(chǎn)前篩查檢出以上兩種突變，建議其進行遺傳性耳聾遺傳咨詢，同時，配偶進行相應(yīng)的遺傳性耳聾基因突變位點篩查，進而分析胎兒是否攜帶相應(yīng)突變位點；而對于有聽力損傷癥狀者，同時建議其直系親屬進行相應(yīng)突變檢測，明確該遺傳因素對家族的影響。109G>A突變是否是致病突變還存在爭議，近來研究發(fā)現(xiàn)其與中、輕度聽力損失相關(guān)，也建議增加為產(chǎn)前篩查GJB2基因的突變位點[15]。

此外，通過耳聾芯片檢出1例線粒體12S rRNA 1555A>G純合型突變，此突變可引起氨基糖苷類致藥物性耳聾。該研究對象自評無聽力損傷，自述未服用過此類藥物。因帶有該基因突變者，使用氨基糖苷類藥物后會造成雙側(cè)永久性聽力損失，不使用則不發(fā)病，建議其在今后避免使用此類藥物。因其為母系遺傳的特點，同時建議其母系親屬進行相應(yīng)突變檢測，明確該遺傳因素對家族的影響，避免使用此類藥物。

因以上突變在中國漢族人群突變情況以及遺傳性耳聾對患者生活質(zhì)量的影響，對于分娩后的新生兒開展遺傳性耳聾基因的篩查也尤為重要，并對攜帶致病突變的新生兒及其親屬進行遺傳指導(dǎo)及婚育指導(dǎo)。

本研究通過直接測序法進一步驗證了耳聾芯片檢測以上4種致病基因的準確性，為進一步大范圍開展耳聾芯片檢測提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。作者在健康孕婦中檢測出遺傳性耳聾基因相關(guān)基因位點突變，其可能會增加下一代聽力障礙的風(fēng)險，進一步證明產(chǎn)前篩查遺傳性耳聾基因的重要性。進行遺傳性耳聾基因的產(chǎn)前篩查，能夠為孕婦提供早期健康的建議，阻止疾病進展。

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Prenatal screening for mutations in GJB2 gene in healthy Han pregnant women

LIShan-shan,WANGLin-lin,LYUWei,YANGShu-fa,YULu

(GeneticMetabolismLaboratory,AffiliatedBeijingObstetricsandGynecologyHospitalCapitalMedicalUniversity/BeijingMaternalandChildHealthCareHospital,Beijing100026,China)

Objective To determinate the prenatal screening of mutations of the major deafness gene GJB2 in healthy Han pregnant women.Methods The gene DNA extraction and amplification was performed in 475 healthy Han pregnant women as the research subjects.9 loci of GJB2,GJB3,SLC26A4 and mitochondria12S rRNA were detected by the DNA microarray analysis.The direct DNA sequencing was used for detecting the GJB2 mutation situation.Results The deafness gene microarray analysis showed six types of pathogenic mutations in 15 research subjects,including 14 cases of heterozygous mutation:3 frameshift mutations in GJB2 gene,non-mutation was detected in 176-191 del 16,235del C and 299-300del AT,35del G;2 missense mutations in SLC26A4 gene,2168A>G and IVS7-2A>G;1 case of mitochondria12S rRNA 1555A>G homozygotic type mutation was detected out.The whole GJB2 coding region was detected by the direct DNA sequencing,including 4 kinds of detected pathogenic mutation 176-191del 16,235del C,299-300del AT and 109G>A,4 kinds of polymorphism 79G>A,341A>G,478A>G and 608T>C and 4 kinds of non-classification mutation11G>A,187G>T,372G>A and 558G>A.Among them,211 subjects carried at least 1 kind of GJB2 mutation,accounting for 44.4% of the detected total number.Conclusion This research is conducive to screening analysis of prenatal deafness gene mutation and assisted genetic counselling for hereditary hearing loss.

mutation frequency; GJB2 gene mutation; inherited deafness

李珊珊，女，碩士，主管技師，主要從事耳聾基因芯片檢測研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.029

A

1672-9455(2015)17-2556-04

2015-03-25

2015-04-10)