林劍勇，鄧益斌，羅艷紅，陸小嬋，黃永秩

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院:1.呼吸內(nèi)科;2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,廣西百色 533000)

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·論 著·

肺癌組織中miRNA-449a的表達(dá)及其臨床意義*

林劍勇1，鄧益斌2△，羅艷紅2，陸小嬋2，黃永秩2

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院:1.呼吸內(nèi)科;2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,廣西百色 533000)

目的 探討miRNA-449a在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 收集右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2011年1月1日至2013年6月30日收治的58例肺癌患者作為研究對(duì)象，采用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miRNA-449a在肺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)量，分析miRNA-449a與臨床病理特征的關(guān)系，并采用熒光電子顯微鏡觀察miRNA-449a模擬物對(duì)體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞株95D細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 鱗癌組和腺癌組miRNA-449a平均表達(dá)量均明顯低于癌旁正常對(duì)照組(t=6.712，P<0.05;t=4.572，P<0.05)，其相對(duì)表達(dá)量與瘤體大小(U=78.412，P=0.012)有關(guān)，與患者年齡(U=920.000，P=0.615)、性別(U=800.000，P=0.215)、病理類型(χ2=4.221，P=0.155)和臨床分期(U=754.000，P=0.009)無關(guān)。與陰性對(duì)照組比較，miRNA-449a模擬物可明顯促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴性。結(jié)論 miRNA-449a在肺癌組織中呈低表達(dá)，可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌基因的作用，可能成為肺癌早期診斷與治療的新分子靶標(biāo)。

miRNA-449a; 肺癌; miRNAs; 分子診斷

microRNA(miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性、非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸，其主要功能是與靶基因mRNA的非編碼區(qū)或編碼區(qū)不完全互補(bǔ)結(jié)合，促使靶基因mRNA降解或抑制轉(zhuǎn)錄后蛋白翻譯過程，并在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡和分化方面扮演著重要角色[1-2]。miRNA-449a是5號(hào)染色體上miRNA-449的編碼產(chǎn)物之一，在結(jié)直腸癌、肝癌和卵巢癌等癌癥中均發(fā)現(xiàn)有表達(dá)且發(fā)揮一定生物學(xué)功能[3]。而miRNA-449a在肺癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能尚不清楚，因此，本研究擬采用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)分別檢測(cè)肺癌組織及遠(yuǎn)端正常組織中miRNA-449a的表達(dá)差異，并觀察其模擬物對(duì)人肺癌細(xì)胞株95D細(xì)胞凋亡的影響，探討其生物學(xué)功能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月至2013年6月在本院就診并經(jīng)手術(shù)病理診斷確診的肺癌患者手術(shù)切除新鮮標(biāo)本58例，其中男40例，女18例;鱗癌22例，腺癌36例;年齡大于或等于50歲42例，年齡小于50歲16例;瘤體大于或等于5 cm 38例，瘤體小于5 cm 20例，取肺癌組織及遠(yuǎn)端對(duì)照正常組織(距癌組織大于5 cm)。所有肺癌患者術(shù)前均未做放療、化療及其他針對(duì)腫瘤的治療。標(biāo)本留取前已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并由患者簽署知情同意書。全部標(biāo)本手術(shù)后30 min內(nèi)保存于液氮中。人肺癌細(xì)胞株95D細(xì)胞用10%胎牛血清(含氨基酸和葡萄糖)的培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑 Tizol試劑盒、LipofectaminTM2000等購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司;AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司;引物及miRNA-449a模擬物的設(shè)計(jì)與合成由上海生工生物工程股份有限公司完成;熒光電子顯微鏡為尼康(Niko)公司產(chǎn)品;PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 從液氮中取組織約500 mg，采用Tizol試劑提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取RNA濃度和純度，當(dāng)A260/A280比值為1.8～2.1認(rèn)為提取的RNA純度合格，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳法鑒定RNA的完整性。當(dāng)28S/18S亮度比值大于2.0認(rèn)為提取的RNA完整性良好。

1.3.2 miRNA-449a定量檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR技術(shù)，以U6為內(nèi)參。(1)內(nèi)參U6引物設(shè)計(jì)：U6逆轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA ACT GC-3′，上游引物為5′-GGG TGC TCG CTT CGG CAG C-3′，下游引物為5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。(2)總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：利用逆轉(zhuǎn)錄引物，把總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其反應(yīng)體系為10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1.5 μL，100 nmol/L dNTPs 0.15 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，RNase抑制劑0.19 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物3.0 μL，總RNA 5.0 μL，加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至15 μL，輕輕混勻后，16 ℃ 30 min;42 ℃ 60 min;85 ℃ 5 min;4 ℃保存。(3)熒光定量PCR檢測(cè)：反應(yīng)體系為2×PCR緩沖液10 μL，20×miRNA-449a特定引物和熒光探針1 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，加DEPC水至20 μL，置ABI 7500熒光PCR儀上按照95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，采集數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

1.3.3 miRNA-449a模擬物抑制細(xì)胞增殖分析 采用LipofectaminTM2000分別將不同濃度的miRNA-449a模擬物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞株95D細(xì)胞進(jìn)行分析，熒光電子顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按試劑說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)資料中的計(jì)量資料均做正態(tài)性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的資料，多組間比較行單因素方差分析及t檢驗(yàn);若不符合正態(tài)分布，兩組各指標(biāo)間的比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較行Kruskal-Wallis分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RNA純度與miRNA-449a的表達(dá) RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280比值為2.06，A260/A230比值為2.21，說明總RNA純度較高，無蛋白及DNA污染。圖1顯示，28S、18S條帶清晰，28S/18S亮度比值大于2.0，說明提取的總RNA完整性好，無明顯降解。癌旁正常對(duì)照組、鱗癌組、腺癌組miRNA-449a平均表達(dá)量分別為(2.74±1.55)、(1.48±1.63)和(1.52±1.54)，3組整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.81，P<0.05)。鱗癌組和腺癌組與癌旁正常對(duì)照組相比較均發(fā)現(xiàn)，miRNA-449a表達(dá)量顯著性降低(t=6.712，P<0.01;t=4.572，P<0.01);鱗癌組miRNA-449a表達(dá)量與腺癌組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 miRNA-449a表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 見表1。將58例肺癌患者按照臨床病理特征因素(年齡、性別、病例類型、臨床分期和瘤體大小)進(jìn)行分類，進(jìn)一步分析miRNA-449a相對(duì)表達(dá)量與肺癌患者臨床特征的關(guān)系，表1顯示，miRNA-449a表達(dá)與瘤體大小有關(guān)(P<0.05)，與其他臨床病理特征無相關(guān)性(P>0.05)。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

臨床特征nmiRNA-449a相對(duì)表達(dá)量UP年齡(歲)<50161.88±0.78920.0000.615≥50421.83±0.91性別男401.91±0.93800.0000.215女181.85±0.82病理類型鱗癌222.01±0.884.221*0.155腺癌361.75±0.81臨床分期Ⅰ～Ⅱ211.55±0.82754.0000.091Ⅲ～Ⅳ371.89±0.78瘤體(cm)<5201.23±0.7378.4120.012≥5380.62±0.59

注：*Kruskal Wallis檢驗(yàn);其余Mann-Whitney檢驗(yàn)。

2.3 miRNA-449a模擬物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，采用MTT比色法測(cè)定各組A值，陰性對(duì)照組、10 mg/mL組和20 mg/mL組A值分別為(1.35±1.02)、(0.71±0.54)和(0.45±0.38)，3組整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=57.33，P<0.05)。圖2顯示，10 mg/mL組和20 mg/mL組細(xì)胞凋亡數(shù)(染成紅色)顯著高于陰性對(duì)照組。

注：a為陰性對(duì)照組;b為脂質(zhì)體對(duì)照組;c為10 mg/mL模擬物組;d為20 mg/mL模擬物組。

圖2 熒光電子顯微鏡下，miRNA-449a誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞株

95D細(xì)胞凋亡情況(化學(xué)發(fā)光法，200×)

3 討 論

肺癌是一種多基因疾病，其發(fā)生、發(fā)展是多因素參與、多種相關(guān)基因失活共同作用的結(jié)果，是高發(fā)病率和高病死率的癌癥之一，也是預(yù)后較差的癌癥之一。miRNA是一類長(zhǎng)約20～23 nt的可調(diào)控基因表達(dá)的高度保守非編碼小RNA，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)或抑制的作用。有資料表明，miRNA-145[4]、miRNA-34a[5]、miRNA-212[6]、miRNA-182[7]等miRNA可通過增加凋亡蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而阻遏腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。此外還發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中miRNA-21的表達(dá)顯著高于良性肺部疾病患者及健康體檢者[8]。因此認(rèn)為，miRNA可能成為腫瘤基因診斷與治療研究的潛在靶標(biāo)，是目前腫瘤領(lǐng)域的研究新熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，miRNA-449a在肺癌組織中的表達(dá)明顯比正常對(duì)照組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且與腫瘤大小有關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別無關(guān)，提示miRNA-449a參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，可能是一項(xiàng)潛在的抑癌因子，但其表達(dá)機(jī)制仍不清楚，可能與表觀遺傳學(xué)(如甲基化等)的調(diào)控有關(guān)。為了驗(yàn)證miRNA-449a對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制，本研究設(shè)計(jì)合成miRNA-449a模擬物，并以陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞株95D細(xì)胞。熒光電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組比較，miRNA-449a模擬物能夠明顯誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，且隨著miRNA-449a濃度增高腫瘤細(xì)胞的凋亡呈上升趨勢(shì)，說明miRNA-449a通過誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抑癌基因的作用，但誘導(dǎo)或阻斷哪些凋亡蛋白的表達(dá)，從而上調(diào)或下調(diào)哪些通路的信號(hào)，還有待進(jìn)一步研究。

盡管本研究結(jié)果初步證實(shí)miRNA-449a在肺癌細(xì)胞中有抑癌基因作用，但體外試驗(yàn)細(xì)胞微環(huán)境畢竟與體內(nèi)不同，有可能因?yàn)榧?xì)胞表觀遺傳學(xué)的改變影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，有待進(jìn)一步在動(dòng)物試驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

總之，miRNA-449a在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑癌基因的作用，可能成為肺癌早期診斷與治療的新分子靶標(biāo)。

[1]Guo H,Ingolia NT,Weissman JS,et al.Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels[J].Nature,2010,466(738):835-840.

[2]Lujambio A,Lowe SW.The microcosmos of cancer[J].Nature,2012,482(7385):347-355.

[3]Yang X,Feng M,Jiang X,et al.miR-449a and miR-449b are direct transcriptional targets of E2F1 and negatively regulate pRb-E2F1 activity through a feedback loop by targeting CDK6 and CDC25A[J].Genes Dev,2009,23(20):2388-2393.

[4]Cho WC,Chow AS,Au JS.Restoration of tumour suppressor hsa-miR-145 inhibits cancer cell growth in lung adenocarcinoma patients with epidermal growth factor receptor mutation[J].Eur J Cancer,2009,45(12):2197-2206.

[5]Duan W,Gao L,Wu X,et al.MicroRNA-34a is an important component of PRIMA-1-induced apoptotic network in human lung cancer cells[J].Int J Cancer,2010,127(2):313-320.

[6]Incoronato M,Garofalo M,Urso L,et al.miR-212 increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand sensitivity in non-small cell lung cancer by targeting the antiapoptotic protein PED[J].Cancer Res,2010,70(9):3638-3646.

[7]徐彪，夏偉，邵寧生，等．肺鱗癌組織Hsa-mir-182差異表達(dá)的研究[J]．中華腫瘤防治雜志，2013，20(16)：1225-1228．

[8]胡俊庭，鮑蘊(yùn)文，白艷，等．肺癌患者血清microRNA-21表達(dá)臨床意義探討[J]．中華腫瘤防治雜志，2014，21(1)：39-42．

Expression and and its clinical significance of miRNA-449a in lung cancer*

LINJian-yong1,DENGYi-bin2△,LUOYan-hong2,LUXiao-chan2,HUANGYong-zhi2

(1.DepartmentofRespiratory;2.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalCollegeforNationalities,Baise,Guangxi533000,China)

Objective To investigate the expression and and its clinical significance of miRNA-449a in lung cancer.Methods Totally 58 patients with lung cancer were selected as research objects from Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities on January 1,2011 to June 30,2013.The expression of miRNA-449a in lung cancer tissues and matched normal tissues were detected by real time PCR.And the relationship between clinical pathological features and the level of miRNA-449a were analysed.Fluorescent electronic microscope was applied to analyze the apoptosis after transfecting mimics of miRNA-449a into non-small cell lung cancer.Results The level of miRNA-449a was significantly lower in squamous carcinoma group and adenocarcinoma group than that of control group(t=6.712，P<0.05;t=4.572，P<0.05;respectively).There was correlation between miRNA-449a and tumor size(U=78.412，P=0.012) and no correlation between miRNA-449a and age(U=920.000，P=0.615),gender(U=800.000，P=0.215),pathological type(χ2=4.221，P=0.155)and clinic stage(U=754.000，P=0.009),allP>0.05.Compared with negative control group,miRNA-449a mimics could induce apoptosis of lung cancer cell 95D with dose-effect dependent.Conclusion miRNA-449a is lower expression in lung cancer,can induced apoptosis,which maybe play a role as a tumor suppressor gene,and as a new molecular targets of early diagnosis and treatment of lung cancer.

miRNA-449a; lung cancer; microRNAs; molecular diagnostic

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金(2011GXNSFA04215)。

林劍勇，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病，尤其是肺癌的基礎(chǔ)與臨床研究?！?/p>

,E-mail:dengyb75@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.011

A

1672-9455(2015)03-0314-03

2014-08-12

2014-10-10)