趙 君， 劉劍光， 吳巧娟， 趙 亮， 許劍文， 肖松華

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游棉花油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

棉花是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有舉足輕重的作用［1-3］。棉花不僅能夠提供重要的天然紡織原料，而且棉子中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、棉子糖、維生素等，棉仁中含有30.00%以上的脂肪，其中亞油酸含量高達(dá)55.60%，為加工高級(jí)保健油的原料，對(duì)預(yù)防和治療冠心病、動(dòng)脈硬化、高血壓和高血脂等心腦血管疾病具有顯著療效［4］。然而，長(zhǎng)期以來(lái)限制棉子高效利用的根本原因在于其中含有1%～2%棉酚及其衍生物。棉酚對(duì)人和單胃動(dòng)物有毒害，食用后胃粘膜組織易被破壞，引起消化功能紊亂，因此棉子這種食物資源未能被充分開(kāi)發(fā)利用［5］。隨著中國(guó)內(nèi)地棉花種植面積的不斷減少以及植棉經(jīng)濟(jì)效益的降低，棉花育種家越來(lái)越重視特種棉花品種的選育，其中低酚棉的種仁棉酚含量低于國(guó)家食用標(biāo)準(zhǔn)(＜0.02%)和國(guó)際食用標(biāo)準(zhǔn)(＜0.04%)，具有重要利用價(jià)值，所以選育低酚棉將是提高棉花綜合利用價(jià)值的一個(gè)重要方向。

棉子含油量是受多基因控制的數(shù)量性狀，而且不同研究者所采用的材料和方法不同，獲得的研究結(jié)果也存在差別，在不同的研究中主要存在上位性、加性和顯性效應(yīng)以及母體影響［6-8］。另外研究發(fā)現(xiàn)，棉子含油量也受環(huán)境的影響［9-10］。棉子油的主要成分是脂肪酸，而棉子中脂肪酸的代謝途徑受到多個(gè)酶的調(diào)節(jié)，其中檸檬酸合成酶和乙酰CoA羧化酶是2個(gè)最關(guān)鍵的限速酶。油酰卵磷脂基因(FAD2-1)是決定脂肪酸不同組分含量的關(guān)鍵酶。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性可以控制棉子蛋白質(zhì)和油脂的比例，預(yù)測(cè)通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的表達(dá)改變棉子油分與蛋白質(zhì)比例，可以提高棉子中的脂肪酸含量，創(chuàng)造高含油量的棉花材料［11］。

為了提高棉花的綜合利用價(jià)值，育種目標(biāo)既要重視皮棉產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、抗病性和抗蟲(chóng)性的改良，又要兼顧棉子種仁含油量的提高。本研究以高含油量和低酚棉種質(zhì)系為試驗(yàn)材料，對(duì)32份棉花種質(zhì)系進(jìn)行遺傳多樣性分析，期望為高油、低酚棉花新品種選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料包含17個(gè)低酚棉品種(系)，其中9份由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，分別是冀棉19、冀棉21、冀棉27、湘棉18號(hào)、遼棉11號(hào)、中棉所18、中棉所20、汾低99和海1，引入后嚴(yán)格自交繁殖保純;8份由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育，分別是蘇研 602、蘇研603、蘇研604、蘇研605、蘇研606、蘇研607、蘇研608和蘇研609，這些材料低酚性狀純合。12個(gè)種仁高含油量品種(系)，分別為荊55263、綿陽(yáng)73-39、RNT78、紫色美棉、澳 siv-2、澳 C、澳L23、蘇聯(lián)棉91系、庫(kù)車(chē)T94-4、遠(yuǎn)93抗354、邯鄲長(zhǎng)絨和M11。另外3個(gè)品種為蘇棉8號(hào)、陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1和泗抗1號(hào)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所保存。

1.2 SSR 分析

取各品種(系)幼嫩葉片，DNA提取方法參照Paterson等［12］的CTAB法。根據(jù)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)公布的遺傳圖譜［13］均勻選取分布于棉花26條染色體上的370對(duì)SSR引物。所有引物信息可從http://www.genome.clemson.edu/projects/cotton 網(wǎng)站下載。分子標(biāo)記名稱(chēng)中的大寫(xiě)字母，如 BNL，JESPR等，代表引物的來(lái)源。Taq酶、dNTPs和PCR反應(yīng)的其他試劑均購(gòu)自北京天為時(shí)代公司。PCR擴(kuò)增與染色參照張軍等［14］的方法。

1.3 棉花種仁含油量的測(cè)定以及脂肪酸組分分析

棉花種仁含油量測(cè)定采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10359-1999測(cè)定方法。收取成熟期相近，成熟好的棉桃，經(jīng)濃硫酸脫絨。精選200粒飽滿(mǎn)種子，使用工具鉗將種殼夾出裂口，除去種殼后獲得種仁，利用研缽分別對(duì)每份種仁進(jìn)行充分研磨變成粉末狀。將濾紙放于105℃烘箱內(nèi)烘干2.5 h，置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫，稱(chēng)質(zhì)量(M1)。將1 g左右棉仁粉放入濾紙包內(nèi)，105℃烘箱內(nèi)烘干2.5 h，置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫，稱(chēng)質(zhì)量 (M2)。將稱(chēng)質(zhì)量過(guò)后的裝有棉仁粉的紙包放入抽提管內(nèi)，使用無(wú)水乙醚浸泡16 h，再使用無(wú)水乙醚抽提8 h，控制抽提速度，保證1 h內(nèi)抽提6～8次。抽提后，取出紙包，靜止過(guò)夜，待殘留乙醚完全散發(fā)后，在105℃烘箱內(nèi)烘干2.5 h，稱(chēng)質(zhì)量(M3)。棉仁含油量計(jì)算公式為:M=(M2－M3)/(M2－M1)×100%。每份樣品含油量數(shù)據(jù)均測(cè)定3次，取平均值，并保留兩位有效小數(shù)。

脂肪酸組成分析參考高建芹等［15］方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)凝膠上清晰可見(jiàn)且有差異的條帶進(jìn)行記錄，按分子量從大到小的順序計(jì)帶，有帶賦值為“1”，無(wú)帶賦值為“0”，將電泳圖譜數(shù)字化，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件NTSYSpc-2.10分析數(shù)據(jù)。利用非加權(quán)類(lèi)平均法(Un-weighted pair group mathematics average，UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析，并繪成樹(shù)狀圖。計(jì)算位點(diǎn)多態(tài)信息含量

2 結(jié)果與分析

2.1 種仁含油量及不同棉種脂肪酸含量分析

在本研究中，我們選擇了其中24個(gè)棉花品種(系)，測(cè)定了其種仁含油量和脂肪酸組分。結(jié)果顯示，24個(gè)品種(系)中包括常規(guī)陸地棉栽培品種(系)12個(gè)，分別是蘇研602、蘇研603、蘇研604、蘇研605、蘇研606、蘇研607、蘇研608、蘇研609、冀棉19、冀棉21、湘棉18號(hào)和泗抗1號(hào)，它們的含油量為28.26% ～32.14%，相互之間不存在顯著差異;但與其他12個(gè)高油品系相比，存在顯著差異。脂肪酸組分方差分析結(jié)果顯示，不同品種(系)之間脂肪酸組分存在顯著差異(表1)，但是在高含油量品種和低含油量品種之間沒(méi)有明顯差異，即脂肪酸不同組分的含量與含油量之間沒(méi)有顯著相關(guān)性(表2)。

表1 不同棉花品種(系)種仁含油量和脂肪酸組分Table 1 The oil content and percentage of fatty acids in different cotton varieties

根據(jù)脂肪酸組分測(cè)定結(jié)果，我們分析了不同品種間飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量。其中，飽和脂肪酸包括肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸;單不飽和脂肪酸包括棕櫚油酸、油酸和花生烯酸;多不飽和脂肪酸包括亞油酸和亞麻酸。結(jié)果顯示，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的含量與含油量之間不存在顯著相關(guān)性。飽和脂肪酸含量變幅為24.00% ～28.20%，其中含量最高的是邯鄲長(zhǎng)絨，最低的是湘棉18號(hào)。單不飽和脂肪酸含量變幅為15.12% ～20.52%，其中含量最高的是荊55263，最低的是蘇研604。多不飽和脂肪酸含量變幅為51.93% ～59.57%，其中含量最高的是蘇研602，最低的是邯鄲長(zhǎng)絨(表3)。

表2 含油量與脂肪酸組分間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients between oil content and percentage of fatty acid

表3 不同棉花品種(系)間飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量Table 3 The contents of saturated and unsaturated fatty acids in cotton varieties

對(duì)24個(gè)品種(系)的含油量和脂肪酸組分的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，在供試的24個(gè)品種(系)中，不同品種(系)的含油量和脂肪酸組分均呈正態(tài)或近似正態(tài)分布;脂肪酸組分中，肉豆蔻酸、硬脂酸和亞麻酸在不同品種(系)中分布比較集中，遺傳多樣性較差。棉花種仁含油量在不同品種之間差異很大，變 幅 為 28.26%～41.06%，變 異 系 數(shù) 為12.17%。其中含油量最高的是 M11，達(dá)到41.06%;最低的是蘇研606，含油量為28.26%。在供試的24個(gè)品種(系)中，棉花種仁脂肪酸組分在不同品種(系)之間存在非常大的差異，其中變異最大的是花生烯酸，變異系數(shù)達(dá)到20.30%;肉豆蔻酸含量變幅為0.61% ～0.92%，其中含量最高的是泗抗1號(hào)，最低的是澳 C;棕櫚酸含量變幅為20.90% ～24.67%，其中含量最高的是邯鄲長(zhǎng)絨，最低的是湘棉18號(hào);棕櫚油酸含量變幅為0.44%～0.59%，其中含量最高的是蘇聯(lián)棉91系，最低的是冀棉19;硬脂酸含量變幅為2.40% ～3.25%，其中含量最高的是泗抗1號(hào)，最低的是蘇研608;油酸含量變幅為14.15% ～19.66%，其中含量最高的是荊55263，最低的是蘇研 605;亞油酸含量變幅為51.66% ～59.26%，其中含量最高的是蘇研602，最低的是邯鄲長(zhǎng)絨;亞麻酸含量變幅為 0.21%～0.40%，其中含量最高的是蘇研608，最低的是庫(kù)車(chē)T94-4;花生稀酸含量變幅為0.22% ～0.47%，其中含量最高的是湘棉18號(hào)，最低的是冀棉19(表4)。

表4 種仁含油量及脂肪酸組分的統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Statistical analysis of oil content and percentage of fatty acid in 24 cotton varieties

2.2 SSR引物篩選及標(biāo)記信息分析

依據(jù)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)構(gòu)建的遺傳圖譜［13］，在各連鎖群每隔10 cM選取1個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)，共選用SSR標(biāo)記370對(duì)。對(duì)供試的32份材料進(jìn)行多態(tài)性初篩，其中190對(duì)引物擴(kuò)增穩(wěn)定，并表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性比率為51.35%(表5)。

其中A亞組多態(tài)性位點(diǎn)百分率為59.16%，D亞組為43.46%。在190個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上共檢測(cè)到609個(gè)等位變異，各位點(diǎn)檢測(cè)到的等位變異數(shù)不同，變幅為2～9個(gè)，平均為3.09個(gè);只檢測(cè)到2個(gè)等位變異的位點(diǎn)有78個(gè)，占總多態(tài)位點(diǎn)的41.05%;檢測(cè)到3個(gè)等位變異的位點(diǎn)50個(gè)，占26.31%;檢測(cè)到4個(gè)等位變異的位點(diǎn)33個(gè)，占17.37%;檢測(cè)到5個(gè)等位變異的位點(diǎn)17個(gè)，占8.95%;檢測(cè)到6個(gè)及6個(gè)以上等位變異的位點(diǎn)僅12個(gè)，占6.32%。檢測(cè)到2～3個(gè)等位變異的位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)的67.38%，說(shuō)明試驗(yàn)選擇的資源中等位變異數(shù)普遍較少，遺傳多樣性較低。190個(gè)位點(diǎn)多態(tài)信息含量(PIC)變幅為0.07～0.81，平均為0.40;多樣性指數(shù)變幅為0.15～0.83，平均為0.46;其中檢測(cè)到最多等位變異數(shù)的標(biāo)記是BNL3383，位于D9染色體，檢測(cè)到的等位變異數(shù)是9個(gè)，PIC值為0.81。A、D亞組分析結(jié)果顯示，A亞組平均等位變異數(shù)為3.25，多樣性指數(shù)為0.49;D亞組平均等位變異數(shù)為3.06，多樣性指數(shù)為0.47，說(shuō)明陸地棉A亞組遺傳多樣性略高于D亞組。D亞組可能攜帶更多的控制重要育種目標(biāo)性狀的基因，在長(zhǎng)期的品種改良中承受著更高的選擇壓力，從而造成更多、更強(qiáng)的選擇牽連效應(yīng)(表6)。

表5 基因組多態(tài)性標(biāo)記分布Table 5 Polymorphic marker distribution on 26 chromosomes of 32 cotton varieties

表6 190對(duì)SSR位點(diǎn)多態(tài)性信息統(tǒng)計(jì)Table 6 Information of 190 polymorphic SSR loci

2.3 遺傳多樣性和系譜分析

明確品種間親緣關(guān)系是育種中親本組配的前提。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件NTSYSpc-2.10分析32份材料的遺傳多樣性。利用非加權(quán)類(lèi)平均法(Un-weighted pair group mathematics average，UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析，并繪成樹(shù)狀圖(圖1)。32份材料被分成5個(gè)類(lèi)群，在第一類(lèi)群中包含本研究所有的19個(gè)陸地棉低含油量品種(系)，分別是蘇研系列品種(系)、冀棉19、冀棉21、冀棉27、遼棉11號(hào)、汾低99、泗抗1號(hào)、中棉所18、中棉所20、TM-1以及蘇棉8號(hào)。第二類(lèi)群和第五類(lèi)群只包含1個(gè)品種，分別是海1和紫色美棉。第三類(lèi)群包含高含油量品種(系)綿陽(yáng)73-39和荊55263。第四類(lèi)群包含剩余的高油品種(系)，分別是 RNT78、澳 siv-2、澳 C、澳 L23、蘇聯(lián)棉91系、庫(kù)車(chē) T94-4、遠(yuǎn)93抗354、邯鄲長(zhǎng)絨和 M11。由分類(lèi)結(jié)果可知，本研究所涉及的32個(gè)品種(系)中的高含油量品種(系)與低含油量品種(系)的遺傳差異比較大，遺傳距離遠(yuǎn)。高含油量品種(系)分布于3個(gè)類(lèi)群，表明高含油量種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)比較豐富。

2.4 標(biāo)記與棉花種仁含油量的關(guān)聯(lián)分析

為減少群體結(jié)構(gòu)和個(gè)體間親緣關(guān)系對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的影響，本研究分別利用TASSEL 2.1軟件［17］的一般線性模型(General linear model，GLM;Q)和混合線性模型(Mixed linear model，MLM;Q+K)程序，將196個(gè)位點(diǎn)的等位變異分別與種仁含油量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

與種仁含油量關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)見(jiàn)表7。采用一般線性模型檢測(cè)到與種仁含油量性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)11個(gè)，分布在9條染色體上，其中A亞組7個(gè)，D亞組4個(gè);混合線性模型檢測(cè)到與種仁含油量性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)9個(gè)，分布在7條染色體上，其中A亞組6個(gè)，D亞組3個(gè)，與標(biāo)記NAU2325和NAU5428連鎖的位點(diǎn)沒(méi)有檢測(cè)到。A12和D3染色體上檢測(cè)到2個(gè)位點(diǎn)，A12染色體上的位點(diǎn)分別是標(biāo)記BNL598和標(biāo)記NAU3294，D3染色體上的位點(diǎn)分別是標(biāo)記NAU2325和NAU4052。一般線性模型檢測(cè)到的位點(diǎn)解釋變異 0.056 0～0.144 9，其中達(dá)到極顯著水平的3個(gè)，分別是A12、D2和A2染色體上的標(biāo)記BNL598、CIR246和NAU5384;采用混合線性模型檢測(cè)到的位點(diǎn)解釋變異 0.043 6～0.132 3，其中達(dá)到極顯著水平的位點(diǎn)3個(gè)，與一般線性模型檢測(cè)到的極顯著位點(diǎn)相同(表7)。

圖1 32份材料的聚類(lèi)分析圖Fig.1 Clustering analysis of 32 cotton germplasm

表7 與棉仁含油量性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)及其對(duì)表型變異的解釋率Table 7 Marker loci associated with oil content trait and their explained phenotypic variations

3 討論

棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，它不僅給人類(lèi)提供了纖維原料，而且種子含有18% ～20%的油脂，棉花種仁直接榨油可生產(chǎn)高質(zhì)量的食用油，由于棉酚存在，極大地限制棉花種仁的利用。低酚棉種仁榨油無(wú)需精煉脫毒，可直接食用，所以選育顯性低酚高含油量棉花種質(zhì)對(duì)今后提高棉花整體利用價(jià)值具有重要意義［4］。本研究利用32份棉子材料其中包含17個(gè)低酚棉品種(系)和12份高油材料，測(cè)定其種仁含油量及脂肪酸組分，結(jié)果顯示，通過(guò)雜交選育的低酚棉品種(系)種仁含油量顯著低于高油材料，這與前人報(bào)道的含油量的遺傳偏向低油親本一致，即通過(guò)多代雜交選育，棉花種仁含油量將會(huì)不斷降低［18］。同時(shí)也有研究結(jié)果表明，棉花的母體效應(yīng)對(duì)子代含油量存在影響，其效應(yīng)要高于遺傳影響，這意味著在品種選育過(guò)程中選擇高含油量材料或低含油量材料做母本，對(duì)雜交后代種仁含油量將會(huì)有顯著影響［6，19］。

利用分子標(biāo)記研究不同棉花品種(系)的遺傳多樣性，分析其遺傳背景的差異，可以為今后通過(guò)配制棉花雜交組合選育高油低酚棉花種質(zhì)提供參考。本研究將32份材料通過(guò)聚類(lèi)發(fā)現(xiàn)，低含油量品種(系)和高含油量品種(系)分為2大類(lèi)，而且這2類(lèi)群之間親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。前人的研究結(jié)果表明，種仁含油量與棉花產(chǎn)量之間沒(méi)有相關(guān)性，與棉酚含量呈正相關(guān)［20-21］。說(shuō)明在棉花產(chǎn)量及相關(guān)性狀的改善和提高時(shí)不會(huì)降低棉花種仁含油量。出現(xiàn)現(xiàn)有品種(系)的含油量顯著低于高油種質(zhì)的含油量的現(xiàn)象，主要有兩方面的原因:(一)棉花種仁含油量的遺傳模式可能會(huì)使雜交后代含油量降低;(二)棉花種仁含油量不是育種家在棉花品種選育過(guò)程中關(guān)注的主要指標(biāo)，導(dǎo)致現(xiàn)有品種(系)含油量的降低。

棉花種仁含油量是數(shù)量性狀，受多基因控制。Yu等［22］利用陸地棉與海島棉回交群體共檢測(cè)到17個(gè)與油份含量相關(guān)的QTLs，分布在12條染色體上，其中位于A12染色體上檢測(cè)到2個(gè)QTLs，其中1個(gè)解釋表型變異23.64%。劉小芳等［23］以陸地棉重組自交系群體為材料共檢測(cè)到8個(gè)與含油量相關(guān)的QTLs，其中位于D7染色體上的1個(gè)QTL在2個(gè)環(huán)境中能同時(shí)檢測(cè)到。李曉娜等以89份半野生棉為材料，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析，在3個(gè)年份環(huán)境下重復(fù)檢測(cè)出12個(gè)與棉仁含油量顯著相關(guān)的位點(diǎn)［24］。本研究檢測(cè)到的與含油量相關(guān)的位點(diǎn)與前人研究部分相同，這與研究材料不同有關(guān)系。另外本研究獲得的與已經(jīng)報(bào)道的不同的與棉仁含油量性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)，可能為棉仁含油量性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供依據(jù)。

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