鄧亞云，吳 薇，張平安

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科 430060)

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·論 著·

Bcr/abl陽性慢性粒細(xì)胞白血病中ASB2和Jak3基因mRNA表達(dá)的研究*

鄧亞云，吳 薇，張平安△

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科 430060)

目的 研究Bcr/abl陽性慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者骨髓中單個核細(xì)胞ASB2和Jak3基因mRNA的表達(dá)，探討B(tài)cr/abl陽性CML中蛋白泛素化與Jak-STAT信號通路的相關(guān)性。方法 收集初診確診為Bcr/abl陽性CML的患者32例(CML組)及34例非白血病和健康人(對照組)作為研究對象，采集骨髓標(biāo)本，采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測ASB2 mRNA和Jak3 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 CML組骨髓細(xì)胞中ASB2 mRNA、Jak3 mRNA表達(dá)量相對于對照組分別升高了29.9、548.7倍，兩組ASB2 mRNA、Jak3 mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且在Bcr/abl陽性CML患者中二者呈正相關(guān)(r=0.571，P<0.01)。結(jié)論 Bcr/abl陽性CML患者骨髓細(xì)胞中ASB2與Jak3有異常表達(dá)，蛋白泛素化與Jak-STAT信號通路的交聯(lián)可能與白血病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并且初次在人體骨髓細(xì)胞中證明ASB2與Jak3共同升高具有相關(guān)性。

Bcr/abl； 慢性粒細(xì)胞白血?。?骨髓； 單個核細(xì)胞； ASB2； Jak3

P210是一種由Bcr/abl基因編碼的具有持續(xù)活性的酪氨酸激酶，被認(rèn)為與慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的發(fā)生有關(guān)，但人們對疾病進(jìn)展中的分子機制仍然不明[1-2]。為了探索Bcr/abl陽性CML的分子機制，本課題組研究了蛋白泛素化與Jak-STAT信號通路作用的關(guān)系。錨蛋白重復(fù)序列和細(xì)胞信號抑制因子盒蛋白(ASB)家族有18個成員，其功能為ECSASB(Elongin B/C-Cullin-SOCS box protein)E3泛素連接酶復(fù)合體的底物識別模塊。通過與Elongin C相互作用，ASB蛋白與Elongin B、Cullin5和Rbx2連接，使底物泛素化[3]。眾所周知，在Bcr/abl陽性CML和CML細(xì)胞系中Jak2異常激活[4]，而關(guān)于同家族成員Jak3的研究較少，僅僅只有CML中發(fā)現(xiàn)Jak3突變的研究[1]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)在HL-60和NB4細(xì)胞系中ASB2的易位表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞的生長抑制并促進(jìn)了細(xì)胞分化[5-6]，以及在Baf3細(xì)胞系和Lin-CD19+IgM-小鼠骨髓細(xì)胞中導(dǎo)致JAK2、JAK3、E2A的降解[7-8]，但這些實驗均在細(xì)胞系中進(jìn)行而非人骨髓細(xì)胞。本研究采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測32例初診Bcr/abl陽性CML患者骨髓中ASB2 mRNA及Jak3 mRNA的表達(dá)情況，以探討二者作為白血病診斷、風(fēng)險分層和指導(dǎo)治療標(biāo)志物的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年7月至2015年1月以形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)(MICM)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為Bcr/abl陽性CML初診患者32例(CML組)的骨髓標(biāo)本，男18例，女14例；年齡47～88歲，平均(67.0±5.2)歲，34例非白血病患者及健康人骨髓標(biāo)本為對照組。

1.2 儀器與試劑 Trizol和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ由TaKaRa公司提供，反轉(zhuǎn)錄試劑盒由Thermo SCIENTIFIC公司提供。PCR分析儀由Applied Biosystem Inc公司生產(chǎn)，Ⅶ7熒光定量PCR分析儀由ABI公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計 利用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站提供的ASB2和Jak3 mRNA序列和BLAST進(jìn)行引物設(shè)計，見表1。所有引物均由上海因維基生物技術(shù)有限公司合成。

表1 基因ASB2、Jak3及β-actin的上、下游引物

1.3.2 mRNA提取和反轉(zhuǎn)錄 采集研究對象骨髓標(biāo)本2 mL，3 h之內(nèi)按照淋巴細(xì)胞分裂液(天津美德太平洋科技有限公司)說明書提取單個核細(xì)胞。Trizol法提取總mRNA。所得RNA A260 nm/A280 nm1.7，符合純度要求。取11 μL RNA模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入1 μL Oligo引物混勻并瞬時離心，65 ℃ 5 min，反應(yīng)體系包括：4 μL Reaction Buffer，2 μL Mix，1 μL RI，1 μL RT。反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。得到的cDNA產(chǎn)物放置在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 RT-PCR檢測 反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上、下游引物各l μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROXⅡ0.4 μL，ddH2O 7.6 μL，總體積為20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s預(yù)變性，94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s，50個循環(huán)。溶解曲線條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。對CML組和對照組2個基因mRNA的表達(dá)采用 Ct進(jìn)行比較。擴(kuò)增效率驗證：對2個目的基因(ASB2、Jak3)進(jìn)行了10倍稀釋，稀釋成5個梯度，目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相差小于5%，且在98%～102%，可以認(rèn)為擴(kuò)增效率近似相等。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR分析ASB2 和Jak3表達(dá) 將相當(dāng)于0.01～100 ng總RNA的cDNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。結(jié)果表明，ASB2、Jak3及β-actin擴(kuò)增曲線中溶解溫度分別為88、89、84 ℃左右，說明擴(kuò)增產(chǎn)物為單一產(chǎn)物。ASB2、Jak3及β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線及二者的擴(kuò)增效率為98%～102%，可以認(rèn)為擴(kuò)增效率近似相等。

2.2 CML組與對照組ASB2和Jak3基因mRNA的表達(dá)情況 對目的基因和參比基因的Ct值檢測結(jié)果顯示，CML組ASB2 mRNA、Jak3 mRNA表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，CML組和對照組ASB2和Jak3 mRNA表達(dá)水平比較見表2。

2.3 Bcr/abl陽性CML患者ASB2 和Jak3基因表達(dá)的相關(guān)性分析 對Bcr/abl陽性CML患者ASB2 mRNA表達(dá)量與Jak3 mRNA表達(dá)量進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān)(r=0.571，P<0.01)。

圖1 CML組和對照組RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

注：與對照組比較，*P<0.01；-表示無數(shù)據(jù)。

3 討 論

盡管在近20年間才被發(fā)現(xiàn)，但Jak-STAT信號通路卻是細(xì)胞生物學(xué)中最著名的信號通路之一。在隨后的研究中，人們證明了Jak-STAT通路是通過細(xì)胞膜將胞外信號傳輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)。隨著科研的深入，目前認(rèn)為超過50種生長因子及細(xì)胞因子位于Jak-STAT信號通路下游，該信號通路廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、生存和轉(zhuǎn)移等重要細(xì)胞活動[9]。哺乳動物主要含有4種Jak家族成員：Jak1、Jak2、Jak3和Tyk2，這些激酶主要與位于膜近側(cè)區(qū)的相對保守區(qū)域Box1和Box2識別模塊結(jié)合[10]，參與受體和其特殊配體的一系列磷酸化作用。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，Bcr-Jak2的融合蛋白及Jak2 V617F突變可導(dǎo)致CML酪氨酸激酶的異常調(diào)節(jié)，可能與CML的發(fā)病過程密切相關(guān)[11]，而人們對于Jak3在CML中的研究甚少。Jak3主要在造血細(xì)胞系中表達(dá)，并且在CML患者骨髓細(xì)胞中存在rs3008和rs3212713突變[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Jak3基因敲除小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷[12-13]，并且伴有骨髓造血的異常調(diào)節(jié)[14]。此外，ASB2蛋白被發(fā)現(xiàn)與ElonginB/C/Cullin5形成E3泛素酶復(fù)合體，其作用底物為Jak2和Jak3[15-16]，導(dǎo)致底物蛋白的降解，但以上實驗均在體外細(xì)胞系中進(jìn)行，而非體內(nèi)活細(xì)胞實驗。

為了探索ASB2與Jak3在Bcr/abl陽性CML中的關(guān)系，本課題組檢測分析了Bcr/abl陽性CML患者骨髓中單個核細(xì)胞標(biāo)本，CML組ASB2 mRNA、Jak3 mRNA表達(dá)水平較對照組分別升高了29.9倍和548.7倍，CML組與對照組ASB2 mRNA、Jak3 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。ASB2基因表達(dá)的顯著升高，激活了E3泛素酶體系，可能導(dǎo)致腫瘤因子的降解，與Jak-STAT信號通路形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)，與CML的發(fā)生機制密切相關(guān)。SOCS盒連接蛋白的激活也被認(rèn)為與Jak家族蛋白的JH1激酶區(qū)域相互作用，具有抑制激酶活性的功能[17-18]，其功能導(dǎo)致STATs基因失活，使下游基因表達(dá)調(diào)控受阻。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)CML組Jak3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較對照組顯著升高，這個結(jié)果是否能說明Jak3與CML的rs3008和rs3212713突變有關(guān)，需進(jìn)行更深入的研究。進(jìn)一步分析ASB2 mRNA與Jak3 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān)(r=0.571，P<0.01)，這個結(jié)果證明Bcr/abl陽性CML中蛋白泛素化與Jak-STAT信號通路具有較高相關(guān)性。

本研究首次在Bcr/abl陽性CML骨髓細(xì)胞中研究蛋白泛素化與Jak-STAT信號通路的相互作用，為白血病的發(fā)病機制研究提供了新的視野。ASB2參與Jak-STAT信號通路的調(diào)節(jié)，可能在調(diào)節(jié)腫瘤因子和原癌基因的過程中起重要作用，其在Bcr/abl陽性CML發(fā)生、發(fā)展中如何激活泛素化，作用的底物種類有多少，是后期研究的方向。進(jìn)一步的研究需要跟蹤不同Asb2-Jak3表達(dá)模式的患者及他們后期的腫瘤發(fā)展。

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Study on expression of ASB2 and Jak3 gene mRNA in Bcr/abl positive chronic myeloid leukemia*

DENGYa-yun,WUWei,ZHANGPing-an△

(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To study the expression level of ASB2 and Jak3 gene mRNA in bone marrow mononuclear cells of the patients with Bcr/abl positive chronic myeloid leukemia(CML) and to investigate the correlation between ubiquitination with Jak-STAT signaling pathway in CML.Methods The bone marrow sample was collected from 32 patients with newly diagnosed Bcr/abl positive CML(CML group) and 34 cases of non-leukemia and healthy individuals(control group),respectively.The expression levels of ASB2 mRNA and Jak3 mRNA were detected by real-time quantitative PCR.Results The expression amounts of ASB2 mRNA and Jak3 mRNA in the bone marrow cells of the CML group were significantly increased by 29.9 and 548.7 times as compared with the control group(t=19.4,38.6，P<0.01),and the expression amounts of ASB2 mRNA and Jak3 mRNA had statistical difference between the two groups (P<0.01),moreover ASB2 mRNA and Jak3 mRNA had positive correlation in the patients with Bcr/abl positive CML(r=0.571，P<0.01).Conclusion ASB2 and Jak3 have the abnormal expression in bone marrow cells of Bcr/abl positive CML patients,suggesting that the crossing-linking between ubiquitination and Jak-STAT signaling pathway may be related with development and progression of leukemiamoreover.Besides,it is preliminarily proved that the common increase of ASB2 and Jak3 has correlation.

Bcr/Abl； chronic myeloid leukemia； bone marrow； mononuclear cell； ASB2； Jak3

國家自然科學(xué)基金資助項目(81200389)。

鄧亞云，男，在讀碩士，主要從事細(xì)胞因子基因與感染性疾病研究?！?/p>

，E-mail:zhangpingan@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.19.002

A

1672-9455(2015)19-2814-03

2015-01-26

2015-04-15)