肖 寒,方 倩

珠海市恙蟲病東方體基因型研究

肖 寒,方 倩

目的 對(duì)廣東省珠海市恙蟲病東方體進(jìn)行基因分型。方法 予高熱期恙蟲病患者靜脈采血后，立刻床旁小白鼠腹腔接種，待發(fā)病后解剖，取其腹壁刮液涂片、吉姆薩染色鏡檢；以巢式PCR進(jìn)行恙蟲病東方體DNA檢測(cè)和序列分析，將結(jié)果進(jìn)行同源性分析。結(jié)果 床旁小白鼠腹腔接種，腹壁刮液涂片鏡檢可見紫紅色圓形、橢圓形、短桿狀恙蟲病東方體菌體。10例恙蟲病患者進(jìn)行特異性的巢式PCR擴(kuò)增，其中6例擴(kuò)增出目的基因片段，陽(yáng)性率為60%。將擴(kuò)得珠海恙蟲病東方體基因片段的DNA序列與基因庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與韓國(guó)株Yonchon株同源性最高,大于95%，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示其與Karp株在同一分支。結(jié)論 珠海市為恙蟲病的自然疫源地，該地區(qū)恙蟲病東方體的基因型與Yonchon株最相近。

恙蟲病;病原體分離；基因分型

Funded by the projet of Zhuhai Health Bureau (No. 2011077)

恙蟲病(Scrub typhus)，又名叢林斑疹傷寒，是由恙蟲病東方體(Orientia tsutsugamushi，Ot)引起的自然疫源性疾病，鼠類為主要傳染源，恙螨為傳播媒介[1]。1930年在日本分離出Ot，首次明確了日本為該病自然疫源地[2]。1948年也在我國(guó)廣州首次分離出病原體。1986年以前我國(guó)恙蟲病主要流行于海南、廣東、浙江、廣西、云南、四川、湖南、西藏及臺(tái)灣等省區(qū)；1990年代以來疫區(qū)迅速擴(kuò)展先后在江蘇、山西、山東、河南、天津、東北等長(zhǎng)江以北地區(qū)發(fā)現(xiàn)了恙蟲病流行[2-3]。由于自然疫源地的地理環(huán)境、季節(jié)流行特點(diǎn)以及恙蟲病東方體基因型不同，各地區(qū)的恙蟲病流行特征亦不相同[4]。因此本試驗(yàn)通過對(duì)廣東省珠海市恙蟲病病原體分離及對(duì)其做基因分型，以便為當(dāng)?shù)貙?duì)恙蟲病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 Ot病原體分離[5-6]取高熱期恙蟲病患者外周靜脈血液4～6 mL，分別床旁腹腔接種于4只6周齡小白鼠，每只約腹腔接種0.8～1.2 mL的恙蟲病患者血液。接種后的小白鼠分籠飼養(yǎng)，每隔約3 h觀察一次，觀察約2周。在2周以內(nèi)若有小鼠意外死亡則予以剔除。約接種2周后，小鼠出現(xiàn)蜷縮、弓背、不喜活動(dòng)、呼吸急促、腹水征等癥狀為發(fā)病。待小鼠發(fā)病后或?yàn)l臨死亡時(shí)，予脫頸椎法處死。對(duì)小鼠進(jìn)行無菌解剖后，取其腹腔滲出液、腹壁刮取物等物涂片、吉姆薩染色、鏡檢。

1.2 巢式PCR法檢測(cè)恙蟲病患者血液標(biāo)本中的OtDNA

1.2.1 OtDNA提取 使用生工SK8224 DNA提取試劑盒提取恙蟲病患者全血標(biāo)本恙蟲病東方體DNA作為模板，針對(duì)Ot 56 KD主要表面抗原基因設(shè)計(jì)引物[7]：第1輪PCR反應(yīng)引物P1: 5′- TACATTAGCTGCGGGTATGACA-3′P2: 5′- CCAGCATAATTCTTCAACCAAG-3′預(yù)計(jì)擴(kuò)增約340 bp 基因片段；第2輪PCR 反應(yīng)引物P3:5′TAGAGCAGAGCTAGGTGTTATGTA-3′，P4:5′TAGGCATTATAGTAGGCTGAGG-3′,由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增的目的基因片段約180 bp 基因片段。

1.2.2 Ot PCR鑒定 按常規(guī)方法從恙蟲病患者血液標(biāo)本中提取DNA作為模板。用巢式PCR鑒定。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 Ot序列測(cè)定及分析 將擴(kuò)增的基因片段送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。將上述測(cè)序陽(yáng)性結(jié)果與Karp、 Yonchon、Kato、Kawasaki、Kuroki序列進(jìn)行對(duì)比。用DNAstar軟件進(jìn)行讀取，用DNAstar軟件與各參考株序列進(jìn)行多重排列、對(duì)比并進(jìn)行同源性分析，同時(shí)用DNAstar軟件計(jì)算一組序列內(nèi)以及組間基因的進(jìn)化距離(Evolutionary distances)，采取計(jì)算進(jìn)化的最短長(zhǎng)度(minimal evolution)的方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 恙蟲病病原體分離 在臨床診斷恙蟲病[1]高熱期患者中，靜脈采取血液標(biāo)本行床旁小鼠腹腔接種。每份血標(biāo)本腹腔接種4只小白鼠，共計(jì)20只。有10只小白鼠出現(xiàn)明顯的立克次體血癥，表現(xiàn)為：身體蜷縮、弓背，不喜活動(dòng)、呼吸稍顯急促及明顯的腹水征等。腹壁刮液后吉姆薩染色，顯微鏡下可見分離的恙蟲病病原體，表現(xiàn)為：成堆分布的圓形或橢圓形、短桿狀紫紅色顆粒，如圖1。

2.2 分子生物學(xué)檢測(cè) 采用巢式PCR對(duì)10例已分離出恙蟲病立克次體患者的血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果6例恙蟲病患者血液標(biāo)本中擴(kuò)增出目的基因片段，約140 bp， PCR陽(yáng)性率為60%。

圖1 感染Ot的小白鼠腹壁刮液吉姆薩染色鏡檢

Fig.1 Microscopic examination of Giemsa staining for wiping liquid from abdominal wall of mice infected withOt

M: 1 kb marker.

圖2 恙蟲病患者血中Ot特異性片段擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(從左向右依次ZH4、ZH5、ZH7、ZH8、M:1kb marker ZH9、ZH10及健康對(duì)照1、健康對(duì)照2)

Fig.2 Tsutsugamushi disease in blood of the patients withOtspecific amplification products

2.3 序列測(cè)定 將目的基因片段測(cè)序，與GenBank的恙蟲病東方體國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行對(duì)比。將以上結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如下：韓國(guó)株Yonchon型(U19903)與ZH4、ZH5、ZH7、ZH8同源性最高達(dá)到95%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹也顯示Karp株(M33004)與ZH9、ZH10在同一分支。

3 討 論

針對(duì)該抗原生物學(xué)分型得到國(guó)際公認(rèn)的恙蟲病東方體有Gilliam、Karp、Kato、TA678、TA686、TA716、TA763、H1877等8個(gè)血清型，其中 Karp、Kato、Gilliam 3個(gè)血清型作為國(guó)際參考株，在我國(guó)以Gilliam型為主[1]。恙蟲病東方體的型別不同，存在的毒力不同，臨床表現(xiàn)的輕重亦有不同。目前對(duì)恙蟲病病原體的分型方法主要包括：血清學(xué)分型與基因分型。賴延?xùn)|等[8]在國(guó)內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)Sta56全長(zhǎng)抗原的重組表達(dá)，并對(duì)其初步評(píng)價(jià)了其替代全細(xì)胞純化抗原應(yīng)用于免疫學(xué)診斷的價(jià)值，為進(jìn)一步研究Sta56抗原蛋白的作用和實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)的診斷打下一定基礎(chǔ)。操敏等[9]對(duì)恙蟲病東方體Gilliam株56 kD外膜蛋白基因進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，以獲得有生物活性的重組蛋白，用于恙蟲病診斷試劑的研制。劉運(yùn)囍等[10]從恙蟲病患者皮膚焦痂提取OT-DNA經(jīng)群引物擴(kuò)增均陽(yáng)性，探明了恙蟲病患者皮膚焦痂內(nèi)含有恙蟲病東方體DNA，從而證實(shí)了患者皮膚焦痂也可以作為分子生物學(xué)檢測(cè)標(biāo)本。分子生物學(xué)診斷技術(shù)能在體外將特異性DNA序列進(jìn)行高效擴(kuò)增，具有特異、敏感、快速等優(yōu)點(diǎn)，從而成為鑒定恙蟲病東方體的重要方法[11]。尤其PCR方法簡(jiǎn)單，出結(jié)果快，對(duì)結(jié)果解釋的主觀因素少，不需提純，所以一般實(shí)驗(yàn)室均可采用[12]。

圖3 6株Ot Sta56基因序列進(jìn)化樹分析

由于 Ot表膜蛋白抗原中含量最豐富的是型特異性抗原(Type Special Antigen,TSA)56 kD蛋白，所以O(shè)t型別具有多樣性；56 kD蛋白是一種暴露在菌體表面的外膜蛋白具有高度保守和抗原結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性等特點(diǎn)，其抗原結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定抗原型別多樣性,該抗原能同群、型特異性單克隆抗體反應(yīng)，表明其具有群和型的特異性[5]。Ot在逐步的傳播過程中，其基因型別通過不斷的演變與進(jìn)化，最終某基因型成為某地區(qū)主要的東方體型別(優(yōu)勢(shì)株)。珠海市與廣東東部所存在相同的Ot型別，可能是由于兩地地理位置較近、兩地居民往來頻繁、鼠類的流竄導(dǎo)致。本研究對(duì)廣東省珠海市恙蟲病東方體進(jìn)行基因分型，將擴(kuò)得的珠海市恙蟲病東方體基因片段DNA序列與基因庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與韓國(guó)株Yonchon株同源性最高，大于95%，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示其與Karp株在同一分支。

本研究通過從恙蟲病患者血液中分離恙蟲病東方體，進(jìn)一步證實(shí)了珠海市為恙蟲病疫源地。因此在地區(qū)應(yīng)積極做好必要的預(yù)防措施，以降低本病的發(fā)生率。主要包括以下幾個(gè)方面[13-14]：①做好滅鼠工作以消滅傳染源;②消滅恙螨切斷傳播途徑：鏟除房屋周圍雜草改善居住環(huán)境衛(wèi)生、減少潮濕增加光照等方法消滅恙螨孳生地；③做好個(gè)人防護(hù)措施以減少發(fā)病率：禁止在草坪上坐臥，避免在接近樹木及雜草叢等地方晾曬衣物；在流行區(qū)進(jìn)行野外生產(chǎn)活動(dòng)或游玩時(shí)，應(yīng)穿長(zhǎng)褲、長(zhǎng)袖以減少皮膚裸露面積；④由于本病目前尚無有效的疫苗可供使用，對(duì)因工作或其他原因而不得不進(jìn)入重疫區(qū)的人員，可通過預(yù)先服強(qiáng)力霉素等藥物達(dá)到預(yù)感染降低發(fā)病率。

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Genotypes of etiology ofOrientiatsutsugamushiin Zhuhai City, China

XIAO Han,FANG Qian

(DepartmentofInfectiousDiseases,theFifthAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zhuhai563003,China)

The genotyping of disease causedOrientiatsutsugamushiin Zhuhai City, Guangdong Province, China was studied. We inoculated them to the abdominal cavity of laboratory rat immediately after collection of the venous blood of patients during febrile period. The autopsy was made after onset of tsutsugamushi disease followed by microscopic examining of the scraping smear of abdominal wall with Wright Giemsa staining. DNA detection and sequence analysis ofOrientiatsutsugamushiwere resorted to nested PCR. Results were administered by homology analysis. Mice inoculated intraperitoneally were found with purplish red circular, oval and short rod strain ofOrientiatsutsugamushiin abdominal wall by scraping smear microscopic examination. Ten cases of tsutsugamushi disease patients were administered with specific nested PCR amplification, 6 out of which were amplified with target gene fragment with 60% of positive rate. By comparing the amplified DNA sequences with sequences of the gene pool, we found that its homology was the highest with the South Korean Yonchon strains for exceeding 95%. The phylogenetic tree showed that it was in the same branch with the Karp strain. Zhuhai City is natural epidemic area of tsutsugamushi disease, and the genotype ofOrientiatsutsugamushiin this area is the most similar with that of Yonchon strain.

tsutsugamushi disease; pathogen separation; genotyping

遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院感染科，珠海 563003

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.010

R376

A

1002-2694(2015)02-0139-04

2014-03-27；

2014-05-19

珠海市衛(wèi)生局課題(No.2011077)