劉海娟，洪 青，羅曉東，李小敏，丁 雪，沈浩賢，陳代雄

粉塵螨Hsp60基因的測(cè)序、克隆和原核表達(dá)

劉海娟，洪 青，羅曉東，李小敏，丁 雪，沈浩賢，陳代雄

目的 探索和發(fā)現(xiàn)粉塵螨新的變應(yīng)原組分。方法 以粉塵螨熱休克蛋白60(Heat shock protein 60，Hsp60)為研究對(duì)象，用簡(jiǎn)并引物PCR方法擴(kuò)增出其cDNA片段，并對(duì)該片段進(jìn)行了序列測(cè)定和分析。同時(shí)，對(duì)該基因片段進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)。結(jié)果與結(jié)論 成功確定粉塵螨Hsp60基因片段cDNA序列；構(gòu)建了pET-28a(+)-Hsp60重組質(zhì)粒，并在E.coliBL21中得到高效表達(dá)。

粉塵螨；Hsp60；基因序列；原核表達(dá)

近年來變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，它已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1-4]。塵螨作為一種重要的吸入性變應(yīng)原在變態(tài)反應(yīng)性疾病的研究中極受重視[5-8]。Voorhorst[9]等在1967年的研究中就已證實(shí)粉塵螨和戶塵螨可引起支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等多種變態(tài)反應(yīng)性疾病，是室內(nèi)主要過敏原。而塵螨中包含的引起變態(tài)反應(yīng)的成分—塵螨變應(yīng)原在研究中一直受到高度關(guān)注。并且，隨著探索的深入，不斷有新的塵螨變應(yīng)原被識(shí)別和發(fā)現(xiàn)[10-11]，這極大地加深了人類對(duì)塵螨變應(yīng)原的認(rèn)識(shí)，推動(dòng)了塵螨過敏性疾病診斷、預(yù)防和治療的進(jìn)步。為探索和發(fā)現(xiàn)粉塵螨新的變應(yīng)原組分，本課題組在既往研究[12]的基礎(chǔ)上，選擇粉塵螨熱休克蛋白60(Heat shock protein 60，Hsp60)為研究對(duì)象，測(cè)定和分析了它的cDNA序列，并對(duì)該基因片段進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 粉塵螨 由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)繁殖，保存于-80 ℃。

1.2 主要材料與試劑 原核表達(dá)載體pET-28a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT-PCR Kit )、EXTaq 酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司(中國(guó)大連)。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化公司。

1.3 方法

1.3.1 粉塵螨總RNA的提取 取粉塵螨300只，加入1mL Trizol勻漿。RNA的提取方法參照Trizol Reagent的說明書進(jìn)行。

1.3.2 粉塵螨cDNA的合成及PCR擴(kuò)增 按照PrimeScript RT-PCR Kit的說明書操作，以提取的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)與塵螨相近物種Hsp60蛋白的特征性和保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，上游引物為5′-gAT GAACCCnATGGAyyTnAArmGngg-3′，下游引物為5′-agTCACCaAAtCCNGGNGCYTTNAC-―3′(引物由Invitrogen公司合成)。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增Hsp60基因片段，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min， 94 ℃ 45 s → 60 ℃ 45 s → 72 ℃ 90 s，72℃ 10 min。其中2-4步，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。

1.3.3 測(cè)序及氨基酸序列分析 將上述擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物送往大連寶生物工程(TaKaRa)公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果和由其編碼的氨基酸序列用BLAST軟件進(jìn)行同源性分析，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行親水性區(qū)域分析(http://www.expasy.org/)。根據(jù)pET-28a(+)質(zhì)粒的序列圖譜，用DNAclub軟件確定酶切位點(diǎn)為BamHⅠ、XhoⅠ。

1.3.4 粉塵螨Hsp60基因片段的擴(kuò)增 根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物為5′-CG GGATCCCCAATGGATTTTAAACGCG-3′，下游引物為5′-CGCTCGAGTCCTGGTGCCT TCACG-3′(下劃線為酶切位點(diǎn))。以上述PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增Hsp60基因片段，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s →56 ℃ 45 s → 72 ℃ 90 s ，72 ℃ 10 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收。

1.3.5 粉塵螨Hsp60基因片段克隆 分別對(duì)pET-28a(+)質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，將酶切后的Hsp60基因片段用T4連接酶連接到pET-28a(+)載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliDH5α中，挑取單菌落提取重組質(zhì)粒，用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。將鑒定后陽(yáng)性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌E.coliBL21，用雙酶切和PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

1.3.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析 將含pET-28a(+)-Hsp60的菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃,280 r/min, 誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)10% SDS-PAGE觀察表達(dá)情況。表達(dá)產(chǎn)物可溶性分析參照Sambrook等[13]介紹的方法進(jìn)行。

1.3.7 重組蛋白質(zhì)譜分析 重組蛋白送廣州輝俊生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序及序列分析 簡(jiǎn)并引物PCR反應(yīng)產(chǎn)物的大小約520 bp，其DNA測(cè)序結(jié)果和由它編碼的氨基酸序列(見圖1)經(jīng)同源性分析，結(jié)果顯示：DNA序列與AchromobacterXylosoxidans熱休克蛋白60相似度為86%，氨基酸序列與AdvenellaKashmirensis熱休克蛋白60的相似度為93%。生物信息學(xué)分析顯示：該蛋白序列中存在多個(gè)可能與免疫原性有關(guān)的親水區(qū)域。

圖1 Hsp60的cDNA序列和編碼的氨基酸序列

2.2 Hsp60基因片段的PCR擴(kuò)增 用含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增Hsp60基因片段，結(jié)果如圖2所示，產(chǎn)物中可見大小基本相符的DNA擴(kuò)增條帶(理論值520 bp)。

Lane M: DNA Marker 2000; Lane 1: PCR products.

圖2 粉塵螨Hsp60基因片段PCR結(jié)果

Fig.2 PCR amplification ofDermatophagoidesfarinaeHsp60

2.3 基因克隆和重組質(zhì)粒鑒定 將PCR產(chǎn)物雙酶切后克隆到經(jīng)酶切的質(zhì)粒pET-28a(+)中，重組子進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示，可見大小相符的目的DNA條帶。

Lane M: DNA Marker 2000; Lane 1: PCR products of recombinant plasmid; Lane 2: Recombinant plasmid digested byBamHⅠandXhoⅠ.

圖3 雙酶切及PCR鑒定

Fig.3 Identification of recombinant plasmid

2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 如圖4所示。pET-28a(+)-Hsp60可表達(dá)約23 kD大小的融合蛋白條帶，與推測(cè)值大小相符。

Lane M: Protein marker; Lane 1: Expression products of pET-28a(+);Lane 2: Expression products of pET-28a(+)-Hsp60.

圖4 pET-28a(+)-Hsp60表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果

Fig.4 Expression of pET-28a(+)-Hsp60

2.5 重組蛋白的可溶性分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE，結(jié)果如圖5所示：重組蛋白在上清和沉淀中均有表達(dá)。

Lane M: Protein marker;

Lane 1: The insoluble expression products of pET-28a(+)-Hsp60;

Lane 2: The insoluble expression products of pET-28a(+);

Lane 3: The soluble expression products of pET-28a(+)-Hsp60;

Lane 4: The soluble expression products of pET-28a(+).

圖5 pET-28a(+)-Hsp60表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析

Fig.5 Soluble analysis of pET-28a(+)-Hsp60 expression product

2.6 重組蛋白質(zhì)譜分析 質(zhì)譜分析結(jié)果顯示：重組蛋白為Hsp60。

3 討 論

目前，塵螨變應(yīng)原的篩選方式通常是先建立塵螨cDNA文庫(kù)，然后以塵螨過敏病人血清為探針，通過對(duì)cDNA文庫(kù)的免疫學(xué)篩選來識(shí)別和發(fā)現(xiàn)新的塵螨變應(yīng)原[14]。本研究的前期工作是以塵螨過敏病人血清為探針，通過免疫印跡方法對(duì)整個(gè)粉塵螨蛋白中的所有變應(yīng)原組分同時(shí)進(jìn)行篩選，然后使用高通量的蛋白組學(xué)分析技術(shù)同時(shí)對(duì)反應(yīng)蛋白條帶中的多個(gè)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行識(shí)別[12]。在此基礎(chǔ)上，本研究選取其中的一個(gè)可能的變應(yīng)原組分—Hsp60，用分子生物學(xué)方法進(jìn)行進(jìn)一步的分析。研究結(jié)果顯示：利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物測(cè)序首次獲得了粉塵螨Hsp60部分cDNA序列，并通過基因克隆和大腸桿菌原核表達(dá)技術(shù)成功表達(dá)出粉塵螨Hsp60(片段)重組蛋白。實(shí)踐證明這是一種塵螨變應(yīng)原分析和篩選的有效方法，為新的塵螨變應(yīng)原的發(fā)現(xiàn)提供了一種新的技術(shù)線路。

Hsp60是熱激蛋白的一種，而熱激蛋白是所有原核生物和真核生物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中或受到理化及病理因素刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)新合成或表達(dá)量增加的一組性質(zhì)和作用基本相似的蛋白質(zhì)。熱激蛋白可被免疫系統(tǒng)識(shí)別，參與抗原的加工和遞呈[15]；同時(shí)，有證據(jù)顯示[16-17]：一些寄生蟲的HSPs可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體，提示其是一種重要的抗原。且粉塵螨Hsp70已被證實(shí)可能是其新的變應(yīng)原組分[18]。因此，粉塵螨在宿主肺部寄生的過程中，其釋放的Hsp60有可能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，甚至激發(fā)人體產(chǎn)生超敏反應(yīng)。但目前還沒有關(guān)于粉塵螨Hsp60及其變應(yīng)原作用的報(bào)告。因此，本研究結(jié)果為對(duì)粉塵螨Hsp60進(jìn)行進(jìn)一步的分析和研究奠定了基礎(chǔ)。

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DermatophagoidesfarinaeHsp60--DNA sequencing,cloning and prokaryotic expression

LIU Hai-juan,HONG Qing,LUO Xiao-dong,LI Xiao-min,DING Xue,SHEN Hao-xian,CHEN Dai-xiong

(DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

We identified newDermatophagoidesfarinaeallergens by DNA sequencing, cloning and prokaryotic expression of Heat shock protein 60 (Hsp60) fromDermatophagoidesfarinae. With degenerate primer polymerase chain reaction (PCR) to amplify theDermatophagoidesfarinaecDNA, the cDNA fragments of the Hsp60 were abundantly obtained. The cDNA sequence and amino acid sequence encoded by it were detected and analysed. Meanwhile, the Hsp60 gene fragment was cloned into the pet-28a vector and transformed intoE.colifor prokaryotic expression of the Hsp60. In this study, the cDNA sequence ofDermatophagoidesfarinaeHsp60 successfully was determined first, and the Hsp60 expressed inE.coliBL21. Results of this research laid a foundation for further analysis and study ofDermatophagoidesfarinaeHsp60.

Dermatophagoidesfarinae; Hsp60; gene sequence; prokaryotic expression

Chen Dai-xiong, Email: daixiongchen@hotmail.com

陳代雄,Email:daixiongchen@hotmail.com

廣州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣州 510182

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.013

R384

A

1002-2694(2015)02-0154-04

2014-03-19；

2014-08-16

廣東省教育廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目(No.2013KJCX0154) 資助

Supported by the grants from the Science Research Foundation from Department of Education of Guangdong Province (No. 2013KJCX0154)