國九英，秦 錚，樊 華，安春麗

粗球孢子菌病原學(xué)鑒定及形態(tài)學(xué)參數(shù)分析

國九英1，秦 錚2，樊 華1，安春麗1

目的 建立粗球孢子菌的形態(tài)學(xué)參數(shù)并對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，為粗球孢子菌病原學(xué)鑒定提供數(shù)字化資料。方法 取粗球孢子菌肺感染患者痰液進(jìn)行巴氏染色，應(yīng)用顯微鏡攝像系統(tǒng)采集粗球孢子菌圖像，通過計(jì)算機(jī)數(shù)字圖像分析系統(tǒng)測量粗球孢子菌的長徑，短徑，周長，面積，計(jì)算其圓球度等一系列形態(tài)學(xué)參數(shù)。應(yīng)用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 測量粗球孢子菌297個(gè)，長徑均值為70.91 μm，最大值為110 μm，最小值為33 μm；短徑均值為54.46 μm，最大值為92 μm，最小值為27 μm；周長最大值為382 μm，最小值 116 μm，平均值為227.60 μm；面積最大值85.93 mm2，最小值8.49 mm2，平均值為30.75 mm2。結(jié)論 利用計(jì)算機(jī)數(shù)字圖像分析系統(tǒng)和SPSS數(shù)據(jù)處理軟件獲得粗球孢子菌長徑、短徑、周長、面積、圓球度等的累加、均值、標(biāo)準(zhǔn)差、最大值、最小值及95%可信區(qū)間等一系列形態(tài)學(xué)參數(shù)。粗球孢子菌形態(tài)學(xué)參數(shù)和數(shù)據(jù)的建立為量化及鑒別該菌提供了可靠的資料。

粗球孢子菌；形態(tài)學(xué)參數(shù)；數(shù)字圖像分析

粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)是一種深部感染真菌，為雙相菌屬。在自然界中通常以菌絲型存在，分隔成段，形成有傳染性的關(guān)節(jié)孢子，稱為關(guān)節(jié)菌絲型；而在人及動(dòng)物組織內(nèi)則形成球形厚壁，產(chǎn)生許多內(nèi)生孢子，稱為孢子型；有時(shí)二者可互相轉(zhuǎn)化[1]。粗球孢子菌主要存在于土壤、空氣、水、動(dòng)物皮毛和糞便中，通過呼吸道、消化道、粘膜及傷口侵入機(jī)體。這種真菌所致的球孢子菌病(Coccidioidomycosis)主要流行于美國西南部的半干旱地區(qū)，在我國較為少見[2]。多數(shù)原發(fā)性球孢子菌感染局限于肺臟，常表現(xiàn)為輕度的自限性呼吸道感染。少數(shù)病例形成播散性致死性全身感染，預(yù)后不佳[3]。肺部感染的粗球孢子菌形態(tài)及大小已有一些描述，但各家報(bào)道的大小不盡一致。數(shù)字圖像處理技術(shù)(digital image processing) 可以對(duì)顯微鏡下微小物體進(jìn)行客觀、精確地測定，可靈活、大量地獲得形態(tài)學(xué)相關(guān)信息，且因具有快速、簡捷易操作等優(yōu)點(diǎn)而倍受關(guān)注[4]。近年來,數(shù)字圖像處理技術(shù)已被用于寄生蟲學(xué)領(lǐng)域的研究中[5]。本實(shí)驗(yàn)采用數(shù)字圖像分析技術(shù)分析引起肺感染的粗球孢子菌的形態(tài)學(xué)特征,旨在為粗球孢子菌病原學(xué)的研究提供更加準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 粗球孢子菌來源及標(biāo)本處理 收集一位確診為肺球孢子菌病患者的痰液。用滅菌的接種環(huán)沾取患者痰液與少許生理鹽水混勻，涂于載玻片上，形成直徑約為1 cm左右的薄膜，自然干燥后，95%乙醇固定，采用巴氏染色(PapanicoiauStain)方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，封片后顯微鏡下觀察。

1.2 圖像采集及形態(tài)學(xué)參數(shù)測量 顯微鏡下觀察粗球孢子菌包囊，選取背景清晰，包囊數(shù)量多的視野，經(jīng)攝像系統(tǒng)采集粗球孢子菌包囊的圖像。使用MetaMorph/DP10/BX41數(shù)字圖像處理系統(tǒng)測量采集到的包囊的長徑、短徑、周長、面積等參數(shù)。計(jì)算出包囊的體積、等效直徑及圓球度[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

痰液中的粗球孢子菌經(jīng)巴氏染色后，孢子體呈褐色、圓形或近圓形，具有較厚的孢子壁，含內(nèi)生孢子(圖1)。從不同視野中共采集了297個(gè)形態(tài)完整的孢子體，測量各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1。孢子體長徑數(shù)據(jù)的分布情況如圖2和表

1所示。孢子體長徑最大值為110 μm，最小值為33 μm，平均值為70.91μm。其中55.89%(166/297)的孢子體長徑主要分布于60～84 μm之間。孢子體短徑數(shù)據(jù)的分布情況如圖3所示。其中53.20%(158/297)的孢子體的短徑在48～68 μm之間，短徑的最大值為92 μm，最小值為27 μm，平均值為54.46μm；孢子體周長數(shù)據(jù)的分布情況見圖4。其中61.28%(182/297)孢子體的周長在197～278 μm之間，其最大值為382 μm，最小值 116 μm，平均值為227.60 μm；孢子囊的面積數(shù)據(jù)分布情況如圖5所示。64.98%的孢子體面積在17～40 μm之間(193/297)，最大值85.93 mm2，最小值8.49 mm2，平均值為30.75 mm2。孢子體的圓球度均值為0.67，最大值為1，最小值為0.30。

圖1 痰涂片標(biāo)本中的粗球孢子菌孢子體(巴氏染色，200×)

Fig.1 Spherules ofCoccidioidesimmitisin sputum (Papanicoiaustain, 200×)

表1 297個(gè)粗球孢子菌孢子體的相關(guān)測量數(shù)據(jù)

圖2 粗球孢子菌孢子體長徑的數(shù)據(jù)分布

Fig.2 Distribution ofCoccidioidesimmitiswith the long diameter in spherules

圖3 粗球孢子菌孢子體短徑的數(shù)據(jù)分布

Fig.3 Distribution of the short diameter in spherules ofCoccidioidesimmitis

圖4 粗球孢子菌孢子體周長的數(shù)據(jù)分布

Fig.4 Distribution of the perimeter inCoccidioidesimmitisspherules

圖5 粗球孢子菌孢子體面積的數(shù)據(jù)分布

Fig.5 Distribution of the area inCoccidioidesimmitisspherules

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)圖像分析技術(shù)對(duì)球孢子

菌病患者痰液中的粗球孢子菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)參數(shù)的測定及分析。測量了297個(gè)孢子體，其結(jié)果這與國內(nèi)外文獻(xiàn)中記載球孢子菌孢子體直徑范圍10～80 μm基本一致[8-9]。進(jìn)一步說明數(shù)字圖像處理技術(shù)在測量粗球孢子菌形態(tài)學(xué)參數(shù)的客觀性。通過本次實(shí)驗(yàn)測量計(jì)算出粗球孢子菌的圓球度均值為0.67，最大值為1，最小值為0.13。圓球度反應(yīng)的是非球形顆粒的形狀與球形的差異，圓球度的值愈小，說明顆粒的形狀與圓球的差異愈大。

我國為粗球孢子菌病的非流行區(qū)，臨床上對(duì)該真菌缺乏了解，且不同的染色方法和攜菌標(biāo)本的不同更加大了認(rèn)識(shí)該菌的難度，容易造成誤診，延誤病情。數(shù)字圖像處理技術(shù)可以對(duì)顯微鏡下微小物體進(jìn)行客觀、精確地測定，可靈活、大量地獲得形態(tài)學(xué)相關(guān)信息，且因具有快速、簡捷易操作等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)外尚未見用此技術(shù)檢測粗孢子菌的報(bào)道。本研究利用數(shù)字圖像處理技術(shù)測量了粗球孢子菌。獲得了其長徑、短徑面積、周長、等效直徑、圓球度等一系列的精確數(shù)據(jù)，不僅補(bǔ)充了該菌的形態(tài)學(xué)資料，還為臨床檢驗(yàn)和診斷粗球孢子菌病提供了有意義的參考依據(jù)。

[1]Anstead GM, Graybill JR. Coceidioidomycosis[J]. Infect Dis Clin North Am, 2006, 20(3):621-643.

[2]Negroni R, Rechavala A. Coccidioidomicosis through history[J]. Rev Argent Microbiol, 2006,38:31.

[3]DiCaudo DJ. Coccidioidomycosis: a review and update[J]. J Am Acad Dermatol, 2006,55:929-942.

[4]Pressley ZM, Foster JK, Kolm P, et al. Digital image analysis: a reliable tool in the quantitative evaluation of cutaneous lesions and beyond[J]. Arch Dermatol, 2007,143(10):1331-1333.

[5]Bing YY, Zhao L, An CL. Analydid of the morphological parameters of Cryptosporidium oocyts of the Shenyang Kunming (KM) mouse origin and the Changchun cattle origin by digital image processing technology[J]. Chin J Zoonoses, 2006,22(12):1104-1107. (in Chinese) 邴玉艷, 趙蕾, 安春麗.沈陽昆明(KM)小鼠源和長春牛源隱孢子蟲卵囊形態(tài)的數(shù)字圖像分析[J].中國人獸共患學(xué)報(bào), 2006, 22(12):1104-1107.

[6]Duan YN, Wang JM, Li R. Two dimension mophorlogical analysis onPneumocystiscariniicysts in rats[J]. J Trop Med, 2003,3(4):430-432. (in Chinese) 段義農(nóng)，王建明，李 榮. 大鼠卡氏肺孢子蟲包囊的二維數(shù)據(jù)分析[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2003,3(4):430-432.

[7]Ke Y, Smith CW, Salaru G, et al. Unusual forms of immature sporulating Coccidioides immitisdiagnosed by fineneedle aspiration biopsy[J]. Arch Pathol Lab Med, 2006,130:97-100.

Etiological identification and morphological parameters ofCoccidioidesimmitis

GUO Jiu-ying1,QIN Zheng2,FAN Hua1,AN Chun-li1

(1.DepartmentofPathogenBiology,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;2.InstituteofRespiratoryDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

In this study, we aimed to establish the morphological parameters ofCoccidioidesimmitis, providing digital data for the etiological identification. Taking sputum of theCoccidioidesimmitispulmonary infection patients for Papanicolaou staining, theCoccidioidesimmitisimages were obtained by computer photographic system, and the length, width, perimeter, and area ofCoccidioidesimmitiswere determined by computer digital image, and then the analysis of these dada were conducted by SPSS. It was found that when 297Coccidioidesimmitiswere measured, the average length, width, perimeter, and area were 70.91 μm, 54.46 μm, 227.60 μm, and 30.75 mm2, respectively. Meanwhile, the length of the maximum values was 110 μm, the width was 92 μm; the largest and least perimeters were 382 μm and 116 μm; and the areas were 85.93 mm2and 8.49 mm2. It seems that the set of morphological parameters provide reliable information for identifyingCoccidioidesimmitis.

Coccidioidesimmitis; morphological parameters; digital image analysis

An Chun-li, Email:cmucl@126.com

國家自然科學(xué)基金(No.81370189)

安春麗，Email：cmucl@126.com

1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，沈陽 110122； 2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院呼吸疾病研究所，沈陽 110001

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.004

R382

A

1002-2694(2015)02-0113-03

2014-08-25；

2014-11-26

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 81370189)