鄭紅云，李 艷△，申復(fù)進(jìn)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科;2.婦產(chǎn)科 430060)

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·論 著·

血清蛋白磷酸酯酶2A水平與宮頸癌的相關(guān)性研究*

鄭紅云1，李 艷1△，申復(fù)進(jìn)2

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科;2.婦產(chǎn)科 430060)

目的 宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，本研究擬在血清學(xué)和組織學(xué)水平共同探討宮頸癌患者蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)水平的變化。方法 分別選擇同期宮頸無病變健康體檢者(健康對照組)30例，高危型人乳頭瘤病毒(hsHPV)感染患者17例和宮頸癌患者23例，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清PP2A蛋白表達(dá)水平；另選取健康對照者24例，hsHPV感染患者18例和宮頸癌患者14例，采用酶活試劑盒檢測組織PP2A活性。結(jié)果 與健康對照組相比，hsHPV感染組血清PP2A水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)組織PP2A酶活性下調(diào)，PP2A活性僅為健康對照組的66%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；宮頸癌組血清PP2A水平下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)組織酶活性顯著下調(diào)，PP2A酶活性僅為健康對照組的45%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與hsHPV感染組相比，宮頸癌組患者血清PP2A水平下調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組織酶活性水平下調(diào)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 宮頸癌患者血清PP2A蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，同時(shí)組織學(xué)水平PP2A酶活性亦下降。該研究結(jié)果為宮頸癌發(fā)病機(jī)制提供了新的資料，為宮頸癌的早期診斷提供了新的靶標(biāo)分子。

宮頸癌； 蛋白磷酸酯酶2A； 人乳頭瘤病毒

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康，其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢[1]。全球每年大約有37萬宮頸癌新發(fā)病例，且病死率高達(dá)50%。據(jù)臨床研究資料顯示，宮頸癌發(fā)病需要一個(gè)較長的癌前病變過程，而早期宮頸癌未出現(xiàn)極其明顯的臨床癥狀或體征，且經(jīng)過有效治療可保證存活率高達(dá)90%以上[2]。因此，宮頸癌的早期篩查顯得尤為重要。目前宮頸癌篩查主要為宮頸涂片和高危型人乳頭瘤病毒(hsHPV)檢測，宮頸涂片敏感度低，重復(fù)性差；hsHPV檢測特異性差，易污染，操作要求高。故尋找新型的宮頸癌篩查方法十分必要。近年相關(guān)研究表明，蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)作為信號通路中的特洛伊木馬，參與細(xì)胞代謝、DNA復(fù)制、基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及凋亡，在抑制腫瘤方面也起到十分重要的作用[3]。目前，已有研究證實(shí)了PP2A與乳腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、白血病等腫瘤的發(fā)展相關(guān)，然而有關(guān)PP2A與宮頸癌的相關(guān)性研究在國內(nèi)少見報(bào)道[4]。因此，本研究擬采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定無宮頸病變體檢者、hsHPV感染者和宮頸癌患者血清PP2A水平，并檢測各組人群組織水平PP2A酶活性。該研究將為宮頸癌早期篩查提供理論依據(jù)，同時(shí)也將為宮頸癌的早期篩查提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

1.1.1 外周血標(biāo)本 選擇2014年9月至2015年2月武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦科住院的宮頸癌患者23例，平均年齡(56.50±10.77)歲(患者均為首次發(fā)病，并經(jīng)宮頸病理組織化學(xué)檢查確診，且未接受放療、化療及其他治療，同時(shí)已排除嚴(yán)重內(nèi)科疾病及其他惡性腫瘤等)；hsHPV感染患者17例，平均年齡(55.90±8.27)歲(患者均為首次檢驗(yàn)，并排除上述疾病)；健康對照組選擇同期無宮頸病變健康體檢者30例(且均已排除上述疾病)，平均年齡(55.73±0.86)歲。收集3組檢查者外周血，分離血清于潔凈無酶EP管，置-20 ℃貯藏待檢。

1.1.2 組織標(biāo)本 留取2015年1～4月武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦科住院宮頸癌患者新鮮腫瘤組織24例、hsHPV感染患者宮頸組織和健康對照組無病變宮頸組織分別為18例和14例，平均年齡分別為(56.16±21.12)、(55.16±10.88)和(55.16±9.58)歲?；颊咴\斷同上。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 HPV檢測 HPV采用透景HPV26分型檢測試劑盒，Luminex200液態(tài)芯片儀檢測。

1.2.2 血清PP2A蛋白水平檢測 試劑盒購于上海博谷生物科技有限公司，采用BioRad全自動酶標(biāo)儀檢測。

1.2.3 PP2A酶活性檢測 采用Promega公司的酶活性檢測試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 ELISA檢測血清PP2A蛋白水平 采用競爭法并設(shè)置復(fù)孔按照如下步驟進(jìn)行檢測：每個(gè)檢測標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔?；静襟E如下：復(fù)溫(室溫放置30 min)；分組(宮頸癌組、hsHPV感染患者、健康對照組、標(biāo)準(zhǔn)品組、空白組)；加樣(100 μL)；加酶標(biāo)溶液(50 μL)；溫育(37 ℃，1 h)；洗板(5次)；顯色(顯色劑A、B各50 μL)；終止(室溫避光反應(yīng)15 min，加終止液50 μL)；讀板(450 nm，30 min內(nèi))；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)樣品PP2A水平。

1.3.2 PP2A酶活性測定 種植細(xì)胞(培養(yǎng)24 h)采用工具藥或轉(zhuǎn)染質(zhì)粒處理；洗細(xì)胞(冷PBS，3次)；裂解(加溫和裂解液100 μL，冰置10 min )；細(xì)胞刮子刮出細(xì)胞，置EP管內(nèi)；離心(4 ℃，16 000 g，15 min)；吸上清液，測定樣品蛋白水平；過柱(Sephadex G-25)，置于冰上備用；制備自由磷標(biāo)準(zhǔn)曲線；依次加入反應(yīng)液，底物，孵育(30 ℃，2 min)；加待檢樣品(設(shè)置3種平行水平)，孵育(30 ℃，30 min)；加等體積終止液，室溫放置15～30 min；讀板(600 nm或630 nm)；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)樣品自由磷水平。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清PP2A蛋白水平見圖1。與健康對照組相比，hsHPV感染患者和宮頸癌組患者血清PP2A蛋白水平均下調(diào)，其中宮頸癌組下降最顯著(圖1)。

2.2 3組血清PP2A水平 見表1。與健康對照組相比，hsHPV感染組血清PP2A水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；宮頸癌組血清PP2A水平下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與hsHPV感染組相比，宮頸癌組血清PP2A水平下調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 3組PP2A酶活性 見圖2。與健康對照組相比，hsHPV感染組PP2A酶活性下調(diào)，PP2A活性僅為健康對照組的66%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；宮頸癌組酶活性顯著下調(diào)，PP2A酶活性僅為健康對照組的45%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與hsHPV感染組相比，宮頸癌組酶活性水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 3組血漿PP2A蛋白水平

組別n年齡(歲)體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)PP2A(pg/mL)健康對照組3055.73±0.8624.28±0.7611.50±1.07hsHPV感染組1755.90±8.2724.52±0.857.87±0.95*宮頸癌組2356.50±10.7724.18±0.685.35±0.48*#

注：與健康對照組相比，*P<0.05；與HPV感染組相比，#P<0.05。

圖2 3組PP2A酶活性

3 討 論

宮頸癌是目前唯一一個(gè)病因明確的惡性腫瘤，HPV感染與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)[5]。根據(jù)其致病能力將HPV分為高危型和低危型，高危型HPV是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因，99%的宮頸癌都與生殖器官感染高危型HPV有關(guān)[6]。誘發(fā)上皮組織惡性增生的高危型HPV包括HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73和HPV-82共15種型別。其中又以HPV-16、HPV-18、HPV-58最為常見。

目前用于宮頸癌早期篩查的方法主要有：(1)宮頸細(xì)胞學(xué)檢查(敏感度低，重復(fù)性差，需結(jié)合陰道鏡檢查進(jìn)行診斷)；(2)組織病理學(xué)(一般用于確診，早期篩查僅針對肉眼可見宮頸病灶的患者)；(3)HPV檢測(特異性差，易污染)；(4)宮頸搔刮術(shù)(靈敏度低，針對陰道鏡陰性但高度懷疑宮頸癌的患者)；(5)鱗狀上皮細(xì)胞抗原檢測(僅針對年輕患者的早期診斷有參考意義)；(6)陰道超聲檢查(特異性差，不易與慢性宮頸炎、宮頸息肉等良性病變相鑒別)。宮頸癌的早期篩查方法雖然眾多，但都存在一定的方法學(xué)缺陷，故尋找新的血清學(xué)篩查指標(biāo)很有必要。

PP2A全酶由異三聚體構(gòu)成，包括結(jié)構(gòu)亞基-A亞基、調(diào)節(jié)亞基-B亞基和催化亞基-C亞基[7]。其為一種絲/蘇氨酸磷酸酶，能對蛋白進(jìn)行可逆性磷酸化修飾，參與了細(xì)胞代謝、DNA修復(fù)、基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及凋亡，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其在機(jī)體能拮抗大多數(shù)蛋白激酶的活性，有望成為腫瘤篩查新的靶標(biāo)分子[8-9]。本研究結(jié)果顯示，hsHPV感染和宮頸癌患者血清中PP2A水平均顯著下調(diào)，且宮頸癌患者血清中PP2A水平下調(diào)更顯著，該研究結(jié)果提示血清學(xué)PP2A聯(lián)合hsHPV水平檢測可能是宮頸癌早期診斷的良好指標(biāo)。

蛋白磷酸2A的癌性抑制因子(CIP2A)作為一種與PP2A相互作用的內(nèi)源性蛋白，在惡性腫瘤中可以負(fù)性調(diào)節(jié)PP2A活性[10]。其在多數(shù)良性組織中不表達(dá)或者低表達(dá)，而在多種惡性腫瘤中均為高表達(dá)，包括胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、肝癌等。而PP2A正好與之相反，更進(jìn)一步證實(shí)了PP2A的抗腫瘤功能。PP2A通過以下機(jī)制抑制腫瘤發(fā)生：(1)自身突變；(2)抑制蛋白激酶B活性；(3)調(diào)節(jié)Raf活性；(4)抑制S6K活性；(5)影響c-Myc穩(wěn)定性；(6)調(diào)控p53；(7)激活Rb家族；(8)調(diào)控Wnt信號通路。在人類黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸瘤、人類多發(fā)性骨髓瘤和上皮鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤的癌細(xì)胞內(nèi)均已發(fā)現(xiàn)了PP2A水平下調(diào)，但是PP2A與宮頸癌的相關(guān)性研究較少[11]。最新的研究進(jìn)展表明，CIP2A是通過抑制PP2A對c-Myc蛋白第62位絲氨酸去磷酸化穩(wěn)定c-Myc的表達(dá)水平，維持細(xì)胞惡性表型，抑制細(xì)胞衰老和凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，hsHPV感染和宮頸癌患者組織PP2A酶活性顯著下調(diào)，且宮頸癌患者組織PP2A酶活性下降更顯著，該研究進(jìn)一步證實(shí)了hsHPV和宮頸癌感染患者PP2A水平顯著下調(diào)，血清PP2A水平可能成為宮頸癌良好的預(yù)測和診斷因子。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示了血清學(xué)PP2A聯(lián)合hsHPV水平檢測可能成為宮頸癌的良好預(yù)測和診斷靶標(biāo)，該研究結(jié)果不僅為宮頸癌的發(fā)病分子機(jī)制提供了新的資料，而且可為臨床宮頸癌的早期診斷提供新的靶點(diǎn)。

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The correlation between serum protein phosphatase 2A level and cervical cancer*

ZHENGHong-yun1,LIYan1△,SHENFu-jin2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory；2.DepartmentofObstetricsandGynecology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective Cervical cancer was one of the most common gynecologic malignancy,this study aimed to discuss serum protein phosphatase 2A (PP2A) levels in patients with cervical cancer at the serological and histological levels.Methods 30 cases of healthy people without cervical lesions (normal control group),17 cases of patients infected by hsHPV (hsHPV group),and 23 cases of patients with cervical cancer (cervical cancer group) were selected.The serum PP2A levels of three groups were detected by ELISA,and the tissue protein PP2A levels were detected by enzyme activity assay.Results Comparing with normal control group,the serum level of PP2A in hsHPV group significantly decreased (P<0.05),and the PP2A activity in tissues also decreased in the hsHPV group(P<0.05),accounting for only 66% of normal control group.The serum PP2A level in cervical cancer group was significantly lower than normal control group (P<0.05),and as well as the PP2A activity in tissues (P<0.05),accounting for only 45% of normal control group.Comparing with hsHPV group,cervical cancer group had significantly lower serum PP2A and tissue PP2A activity (P<0.05).Conclusion Both of the serum PP2A level and its activity in tissues significantly decreased in patients with cervical cancer.The result of this study could provide new data for the mechanism research of cervical cancer and a new target molecule for its early diagnosis.

cervical cancer； protein phosphatase 2A； HPV

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81100959)；國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)資助項(xiàng)目(財(cái)社[2010]305號)。

鄭紅云，女，博士，主管技師，主要從事分子診斷與個(gè)體化醫(yī)療方面的研究?！?/p>

,E-mail：yanlitf@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.002

A

1672-9455(2015)24-3614-03

2015-03-25

2015-06-15)