王方平，張平安，鄧亞云，吳 薇

(武漢大學人民醫(yī)院檢驗科 430060)

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·論 著·

Notch1基因檢測對不同分型急性髓系白血病的診斷價值*

王方平，張平安△，鄧亞云，吳 薇

(武漢大學人民醫(yī)院檢驗科 430060)

目的 研究不同分型的急性髓系白血病(AML)患者骨髓中單個核細胞Notch1基因mRNA的表達。方法 收集初診的102例AML患者(M1型18例，M2型41例，M3型16例，M4型14例，M5型13例)和34例對照者(非白血病和健康人，其中非白血病患者和健康人Notch1基因mRNA表達無差異)骨髓，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測Notch1基因mRNA表達情況。結果 102例AML患者骨髓中Notch1基因mRNA表達量相對于對照組升高了477.7倍，差異有統(tǒng)計學意義(t=51.0，P<0.05)。不同分型AML患者骨髓中，M1、M2、M4、M5型AML之間Notch1基因mRNA表達量無差異，但均低于M3型，與M3差異有統(tǒng)計學意義(t=4.87，5.24，3.26，5.75，P<0.05)。結論 不同分型的AML患者骨髓Notch1基因表達均存在異常，并且發(fā)現(xiàn)M3型與其他類型AML表達有差異，該機制可能表明Notch1基因在不同亞型AML發(fā)生和發(fā)展中所起作用不同。

急性髓系白血病； 骨髓單個核細胞； Notch1基因； 聚合酶鏈反應

急性髓系白血病(AML)全世界的發(fā)病率為2.25/10萬人，我國發(fā)病率為5.68/10萬人，是成年人最常見的急性白血病[1]。目前AML的治療仍以化療為主，但化療藥物的耐受及化療緩解后復發(fā)仍然是治療的主要障礙，因此迫切需要尋求新的治療方法。Notch基因是一個由細胞外亞基NEC(NEC)和跨膜亞基NTM(ICN)組成的二聚體跨膜受體，哺乳動物體內(nèi)表達4種Notch受體，5種Notch配體[2]。配體結合到受體，引起γ分泌酶切割掉細胞外亞基NEC，并釋放出細胞內(nèi)亞基ICN[3]。釋放出的ICN轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，誘導相關致癌基因的表達[2]。近年來，關于Notch信號通路在惡性白血病中的報道充滿爭議，Lobry等[4]和Kannan等[5]研究表明，Notch信號通路的活化能抑制AML患者細胞的生長。但Kode等[6]認為，成骨細胞中活化的β鏈蛋白激活刺激Jagged1的表達，隨后激活Notch基因在造血干細胞中表達，最終導致AML發(fā)生。上述研究表明，Notch基因可能具有致癌與抑癌的雙重作用，這可能是由于組織來源不同、腫瘤發(fā)展階段差異及疾病屬于不同亞型等導致[7]。因此，本研究收集患者骨髓細胞，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測不同分型AML患者骨髓單個核細胞中Notch1基因mRNA的表達量，探討Notch1基因與AML不同分型之間的關系，為不同分型AML白血病的診斷及預后評估提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年6月至2015年5月以形態(tài)學、免疫學、遺傳學和分子生物學診斷標準確診為AML的102例初診患者骨髓標本作為AML組，其中男52例，女50例。根據(jù)FAB分型標準將AML分為M1型18例，M2型 41例，M3型16例，M4型14例，M5型13例。以34例非AML白血病患者和健康人骨髓作為對照組。

1.2 試劑與儀器 Trizol和SYBR Premix Ex Taq II由TaKaRa公司提供，反轉(zhuǎn)錄試劑盒由Thermo SCIENTIFIC公司提供。PCR分析儀由Applied Biosystem Inc公司生產(chǎn)，VII7熒光定量PCR分析儀由ABI公司生產(chǎn)。

1.3 研究方法

1.3.1 引物設計 利用美國國立生物技術信息中心網(wǎng)站中提供的Notch1 mRNA序列和BLAST進行引物設計，見表1。所有引物均由上海維基生物科技有限公司合成。

表1 基因Notch1、β-actin的上、下游引物

1.3.2 mRNA提取和反轉(zhuǎn)錄 采集研究對象骨髓2 mL于EDTA抗凝試管中，按照淋巴細胞分裂液說明書(天津美德太平洋科技有限公司)提取單個核細胞。Trizol法提取總mRNA并將其進行純度分析，當A260 nm/A280 nm為1.8時方可用于下一步研究。取11 μL RNA模板進行反轉(zhuǎn)錄，加入1 μL oligo引物混勻并瞬時離心，65 ℃ 5 min，反應體系：4 μL Reaction Buffer，2 μL Mix，1 μL RI，1 μL RT。反應條件：42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。得到的cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光定量PCR檢測 反應體系為cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROX Ⅱ 0.4 μL，ddH2O 7.6 μL，總體積20 μL。2個基因(Notch1、β-actin)的擴增反應條件均為94 ℃30 s預變性，94 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃35 s，50個循環(huán)。溶解曲線條件：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。對AML各組及AML組和對照組基因mRNA的表達采用目標擴增產(chǎn)物達到設定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)(Ct)值進行比較。擴增效率驗證：本研究分別對Notch1和β-actin基因進行10倍稀釋，稀釋5種梯度，目的基因和內(nèi)參基因擴增效率相差小于5%，且在98%～102%，可以認為擴增效率近似相等。

2 結 果

2.1 實時熒光定量PCR分析Notch1表達 以cDNA作為模板，進行實時PCR擴增，制作標準曲線和溶解曲線。結果表明，Notch1及β-actin溶解曲線只有單一峰。瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出目的條帶單一，見圖1，而且目的基因片段的長度與預期設計的長度符合，說明引物特異性較好。Notch1及β-actin的標準曲線及二者的擴增效率分別為98%、102%,可以認為二者擴增效率近似相等。

2.2 AML組與對照組Notch1基因mRNA表達情況 對實驗組和對照組Notch1基因mRNA的表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，AML患者組Notch1 mRNA表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且M3與M1、M2、M4型、M5型之間Notch1 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、2。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 不同分型AML組和對照組之間Notch1 mRNA ΔCt值

組別Mean±SΔΔCt2-(ΔΔCt)PΔCt(Notch1) AML-M17.7±0.9-8.7415.90.05 AML-M27.6±0.9-8.8445.70.05 AML-M36.4±0.6-10.010240.05 AML-M47.3±0.5-9.1548.70.05 AML-M58.1±0.6-8.3315.20.05 AML7.5±0.9-8.9477.70.05 Control16.4±0.8---

注：ΔΔCt=ΔCtAML組-ΔCt對照組。

表2 不同分型患者組之間Notch1 mRNA ΔCt值兩兩比較

續(xù)表2 不同分型患者組之間Notch1 mRNA ΔCt值兩兩比較

注：ΔΔCt=ΔCtMN-ΔCtMM(N>M)。

3 討 論

Notch基因在細胞生長發(fā)育過程中起關鍵作用，參與多系統(tǒng)干細胞自我更新和分化，而且Notch信號傳導失調(diào)在血液惡性腫瘤和其他各種實體腫瘤中都有報道[9-10]。Notch基因廣泛參與腫瘤細胞的信號調(diào)節(jié)，在T細胞淋巴瘤、宮頸癌中，活化的Notch基因起致癌作用[11-12]。而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中它又是一種腫瘤抑制劑[13]。研究發(fā)現(xiàn)，白血病的發(fā)生與Notch基因及其介導的信號傳導通路密切相關，Notch信號參與調(diào)節(jié)淋巴細胞成熟的多個階段，在T急性淋巴細胞白血病中Notch1信號通路的分子機制不明，突變的Notch1基因可能與其他多種致癌因子共同作用[14]。

FAB分型是根據(jù)骨髓細胞形態(tài)學和細胞化學特征，尤其是原始細胞的數(shù)量和形態(tài)來分型，一共分為M0～M78型，其中M3型白血病又叫急性早幼粒性白血病，具有特殊的臨床表現(xiàn)、形態(tài)特征，以及區(qū)別于其他亞型的基因特征。近來Grieselhuber等[15]報道，初期的急性早幼粒細胞白血病(APL)骨髓標本與其他AML亞型相比較Jagged1表達量較高，在細胞系水平誘導PML-RARA的表達提高了Jagged1蛋白表達水平，從而加強了γ分泌酶切割細胞外亞基NEC，Notch抑制劑能減少APL細胞的生長，這表明活化的Notch基因可能在APL中扮演著致癌角色。γ分泌酶抑制劑(GSI)可通過抑制Notch基因受體或配體抑制Notch基因活性[3]。因此，Notch基因抑制劑是一種非常有前途的抑癌劑，用來治療某些癌癥，如APL和急性淋巴細胞性白血病等[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，Notch1基因不僅在健康人與AML患者單核細胞內(nèi)表達顯著不同，升高了477.7倍(t=51.0，P<0.05)，而且在不同F(xiàn)AB分型的AML中表達也有差異。其中M3型比M1、M2、M4及M5型表達量高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這可為臨床診斷及治療M3型AML提供輔助依據(jù)。

目前Notch基因抑制劑作為一種前瞻性治療藥物，已經(jīng)有了較為深入的研究，以上研究為利用GSI治療不同分型AML提供了一定的指導作用。

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Study on the diagnostic value of Notch1 mRNA in different subtypes of acute myelocytic leukemia patients*

WANGFang-ping,ZHANGPing-an△,DENGYa-yun,WUWei

(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To explore the expression of Notch1 mRNA of mononuclear cells in marrow of patients with different subtypes of acute myelocytic leukemia (AML).Methods Marrow samples were respectively collected from 102 cases of newly diagnosed patients with AML (AML group,including 18 cases of M1,41 cases of M2,16 cases of M3,14 cases of M4and 13 cases of M5) and 34 cases of controls (control group,including non-hematopathy patients and healthy individuals,who had similar expression levels of Notch1 mRNA).Expression levels of Notch1 mRNA were detected by real-time quantitative PCR.Results Comparing with control group,the expression level of Notch1 mRNA of AML group increased by 477.7 times,and was significantly higher than that of control group (t=51.0,P<0.05).There were no differences of the expression levels of Notch1 mRNA among the patients with M1,M2,M4and M5leukemia (P>0.05),however,they were significantly lower than that of the patients with M3leukemia,with statistical differences(t=4.87,5.24,3.26,5.75,P<0.05).Conclusion AML patients had abnormal expression of Notch1 gene in marrow,and the expression level of Notch1 gene in M3 leukemia patients were significantly different from the patients with other subtypes of AML,which indicated that Notch1 mRNA plays different roles in different subtypes of AML.

acute myelocytic leukemia; bone marrow mononuclear cells; Notch1； PCR

國家自然科學基金資助項目(81200389)。

王方平，女，碩士，檢驗醫(yī)師，主要從事免疫學檢驗研究?！?/p>

，E-mail：zhangpingan@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.003

A

1672-9455(2015)24-3617-03

2015-06-19

2015-08-10)