黃遠(yuǎn)帥,周煒鑫,羅彬瑞,郭天虹

(1.四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，四川瀘州 646000;2.四川醫(yī)科大學(xué)研究生院，四川瀘州 646000)

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·論 著·

循環(huán)miR-145和miR-484在乳腺癌診斷中的研究*

黃遠(yuǎn)帥1,周煒鑫2,羅彬瑞2,郭天虹2

(1.四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，四川瀘州 646000;2.四川醫(yī)科大學(xué)研究生院，四川瀘州 646000)

目的 探索乳腺癌血漿中差異表達(dá)的微小RNA(miRNA)，為檢測(cè)乳腺癌尋找全新的生物標(biāo)志物，并確定其診斷價(jià)值。方法 采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)檢測(cè)訓(xùn)練組30例乳腺癌患者和20例健康對(duì)照者血漿中的候選標(biāo)志物，再盲法驗(yàn)證20例乳腺癌患者和20例健康對(duì)照者候選標(biāo)志物的診斷效能。結(jié)果 訓(xùn)練組共發(fā)現(xiàn)6個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中miR-145和miR-484差異最顯著，與其他4個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)盲法驗(yàn)證，二者聯(lián)合診斷可有效區(qū)分乳腺癌患者與健康對(duì)照患者，受試者工作曲線下面積為0.965，靈敏度和特異度分別為91.3% (95%CI： 85.2%～95.4%)和90.8%(95%CI： 83.7%～93.6%)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為91.0%，陰性預(yù)測(cè)值為91.0%。結(jié)論 血漿中miR-145和miR-484是乳腺癌潛在的診斷標(biāo)志物。

乳腺癌； 微小RNA-145； 微小RNA-484； 受試者工作曲線下面積； 靈敏度

乳腺癌是由乳腺導(dǎo)管上皮發(fā)生的惡性腫瘤，是婦女的常見(jiàn)惡性腫瘤，占99%，男性?xún)H占1%[1]。全球每年約有120萬(wàn)婦女患乳腺癌，50萬(wàn)人死于乳腺癌，我國(guó)雖屬乳腺癌低發(fā)地區(qū)，但隨著生活水平的提高和家庭人口的簡(jiǎn)單化，近幾年有明顯上升的趨勢(shì)[2]。目前乳腺癌的診斷包括：病理學(xué)檢查、影像學(xué)檢查及血清標(biāo)志物輔助檢查。病理活檢是乳腺癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因?yàn)槿〔暮蛣?chuàng)傷性等限制了它的應(yīng)用。影像學(xué)檢查包括乳腺X線攝影(乳腺鉬靶照相)、CT、彩超、MRI等，是乳腺癌檢測(cè)的重要手段，但由于其放射性損傷和假陽(yáng)性率高，檢測(cè)費(fèi)用也偏高，因此不適合常規(guī)體檢。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目有癌胚抗原、糖類(lèi)抗原153等，但是無(wú)論是單項(xiàng)檢測(cè)還是聯(lián)合應(yīng)用，其靈敏度和特異度都不夠理想，只能作為一種輔助檢查手段[3-4]。因此尋找一種新的，診斷效能高的乳腺癌診斷標(biāo)志物顯得十分重要。微小RNA(miRNA)在人類(lèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起十分重要的作用，它們參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、黏附及死亡等生物學(xué)過(guò)程，這些與癌癥的形成及演變都密切相關(guān)[5]。近年來(lái)，有關(guān)miRNA在診斷疾病價(jià)值方面的研究越來(lái)越受到重視，血清/血漿miRNA表達(dá)穩(wěn)定，檢測(cè)方便，損傷小，是理想的癌癥診斷標(biāo)志物。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及診斷中的應(yīng)用[6-9]。本研究旨在尋找乳腺癌的特異生物標(biāo)志物——miRNA，并評(píng)價(jià)其在乳腺癌診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集 收集四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011年7月至2014年7月收治的乳腺癌患者50例作為腫瘤組，年齡34～70歲，平均59歲；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期20例，Ⅲ期18例，Ⅳ期5例。入選條件：(1)女性；(2)病理檢查確診為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；(3)未行手術(shù)或放、化療等任何治療；(4)臨床病理資料完整。同時(shí)收集門(mén)診體檢者40例作為健康對(duì)照組，男5例，女35例；年齡35～68歲，平均60歲。將這兩組標(biāo)本分為訓(xùn)練組(乳腺癌患者30例和健康對(duì)照者20例，用于篩選具有診斷價(jià)值的miRNA)和驗(yàn)證組(乳腺癌患者20例，健康對(duì)照者20例，用于鑒別篩選出的miRNA的診斷價(jià)值)。腫瘤組血漿標(biāo)本采集于患者乳腺癌確診后和治療前；兩組受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)訓(xùn)練組候選標(biāo)志物 先用Trizol試劑提取腫瘤組和健康對(duì)照組血漿標(biāo)本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)訓(xùn)練組50例血漿標(biāo)本中的miRNA，選擇RNU6B (U6)作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(△Ct=△CtmiR-△CtU6)，相對(duì)表達(dá)量以2-△Ct表示[10]。所用試劑為T(mén)aqman human miRNA assay kit，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 組間數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)之間兩兩比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Graph PadPrism V4.03軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，然后將差異miRNA帶入驗(yàn)證組驗(yàn)證其診斷效能[11]。用受試者工作曲線(ROC)及曲線下面積(AUC)比較不同miRNA區(qū)分乳腺癌患者和健康者的能力，計(jì)算其靈敏度、特異度。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌特異miRNA篩選 乳腺癌組(30例)和健康對(duì)照組(20例)共50例標(biāo)本經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)，初步篩選出6個(gè)顯著表達(dá)的miRNA(miR-16、miR-21、miR-145、miR-191、miR-210、miR-484)，見(jiàn)表1。除了miR-145在乳腺癌組中表達(dá)降低以外，其余都呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中miR-145和miR-484在乳腺癌組和健康對(duì)照組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。圖中方框內(nèi)橫線代表中位數(shù)，方框所表示的區(qū)域指25%～75%百分位數(shù)區(qū)間，方框外的小橫線代表10%～90%的百分位數(shù)區(qū)間，小圓點(diǎn)指在10%～90%的百分位數(shù)區(qū)間以外的值。

表1 乳腺癌組顯著表達(dá)的miRNA

圖1 miR-484和miR-145在乳腺癌組和健康對(duì)照組中相對(duì)表達(dá)情況

2.2 miR-484和miR-145鑒別乳腺癌的診斷價(jià)值 檢測(cè)驗(yàn)證組miR-484和miR-145的相對(duì)表達(dá)量，單獨(dú)使用miR-484和miR-145作為乳腺癌的標(biāo)志物作ROC曲線，得到AUC分別為0.928(95%CI： 0.901～0.959)和0.623(95%CI： 0.513～0.725)，見(jiàn)圖2。為了提高腫瘤的診斷價(jià)值，聯(lián)合使用miR-484和miR-145一起作為區(qū)分乳腺癌患者與健康對(duì)照者的生物標(biāo)志物作ROC曲線，得到AUC為0.965(95%CI： 0.939～0.984)，見(jiàn)圖3。此時(shí)靈敏度和特異度分別為91.3%(95%CI： 85.2%～95.4%)和90.8%(95%CI： 83.7%～93.6%)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為91.0%，陰性預(yù)測(cè)值為91.0%。

圖2 單獨(dú)使用miR-484和miR-145作為乳腺癌標(biāo)志物的ROC曲線及AUC

圖3 聯(lián)合使用miR-484和miR-145作為乳腺癌標(biāo)志物的ROC曲線及AUC

3 討 論

本研究通過(guò)對(duì)30例乳腺癌患者和20例健康對(duì)照者血漿使用qRT-PCR檢測(cè)，共篩選出6個(gè)候選標(biāo)志物，再通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析找到差異最顯著的2個(gè)標(biāo)志物——miR-484和miR-145，然后進(jìn)行診斷價(jià)值評(píng)價(jià)。單獨(dú)使用miR-484和miR-145作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物時(shí)，其ROC的AUC分別為0.928(95%CI： 0.901～0.959)和0.623(95%CI： 0.513～0.725)，診斷效能不甚理想。為了提高乳腺癌的診斷價(jià)值，聯(lián)合使用miR-484和miR-145作為區(qū)分乳腺癌患者與健康對(duì)照者的生物標(biāo)志物，ROC的AUC為0.965(95%CI： 0.939～0.984)，此時(shí)靈敏度和特異度分別為91.3%(95%CI： 85.2%～95.4%)和90.8%(95%CI： 83.7%～93.6%)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為86%，陰性預(yù)測(cè)值為91%。說(shuō)明miR-484和miR-145對(duì)乳腺癌的診斷有十分重要的價(jià)值，雖然本研究數(shù)據(jù)顯示了較好的診斷效能，但若要應(yīng)用于臨床，仍需擴(kuò)大標(biāo)本量和細(xì)化分組，或?qū)θ橄侔┓制诜中驮龠M(jìn)行標(biāo)志物的篩選，以提高診斷的特異性。

Li等[12]比較了19例胰腺癌患者和10例健康對(duì)照者血清miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-484在胰腺癌中表達(dá)顯著增高；Vecchione等[13]發(fā)現(xiàn)在對(duì)化療不敏感的卵巢癌中miR-484表達(dá)減低；另外關(guān)于miR-484與惡性腫瘤的關(guān)系，有研究指出其在表皮惡性黑色素瘤中(相對(duì)于良性黑色素痣而言)是10個(gè)重要的上調(diào)miRNA之一[14]。Volinia和Croce[15]通過(guò)分析466例乳腺癌患者的生存情況認(rèn)為，miR-484水平的高低與Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌的預(yù)后有重要相關(guān)性。miR-145是公認(rèn)的抑癌基因，在多種腫瘤的發(fā)生中，通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)從而達(dá)到抑癌作用[16-17]?？梢?jiàn)各種miRNA在腫瘤中的表達(dá)并非特異的，因此，單獨(dú)將某一種miRNA作為癌癥的診斷標(biāo)志物是不理想的，所以在單獨(dú)使用miR-484作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物時(shí)，在ROC的AUC達(dá)0.928的情況下，為了增加其特異性和提高診斷效能，本研究依然考慮將miR-484和miR-145作為聯(lián)合診斷標(biāo)志物來(lái)計(jì)算其診斷效能，結(jié)果顯示，聯(lián)合診斷ROC的AUC達(dá)0.965，診斷效能有了明顯提高。結(jié)果中顯示miR-484在乳腺癌中高表達(dá)，而miR-145在乳腺癌中低表達(dá)，這也為后期研究提供了很好的思路，即研究標(biāo)志物的作用機(jī)制。這樣，標(biāo)志物不僅可以作為疾病診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也可以闡明疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，縱向加深了研究的深度。

綜上所述，盡管本研究尚有一些局限，但血漿miR-484和miR-145仍不失作為乳腺癌有效的診斷標(biāo)志物，下一步研究可加大標(biāo)本量驗(yàn)證和進(jìn)行miRNA對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制的研究。

[1]Liu LY,Wang M,Ma ZB,et al.The role of adiponectin in breast cancer:a meta-analysis[J].PLoS One，2013，8(8):e73183.

[2]Jia Y,Lu Y,Wu K,et al.Does night work increase the risk of breast cancer? A systematic review and meta-analysis of epidemiological studies[J].Cancer Epidemiol，2013，37(3):197-206.

[3]Zob D,Vasilescu M,Gruia M,et al.Breast cancer.Screening criteria[J].Chirurgia (Bucur)，2013，108(4):557-562.

[4]Gopal S,Krysiak R,Liomba NG,et al.Early experience after developing a pathology laboratory in Malawi,with emphasis on cancer diagnoses[J].PLoS One，2013，8(8):e70361.

[5]Kothandan R,Biswas S.Search for signatures in miRNAs associated with cancer[J].Bioinformation，2013，9(10):524-527.

[6]Godfrey AC,Xu Z,Weinberg CR,et al.Serum microRNA expression as an early marker for breast cancer risk in prospectively collected samples from the Sister Study cohort[J].Breast Cancer Res，2013，15(3):R42.

[7]Schrauder MG,Strick R,Schulz-Wendtland R,et al.Circulating micro-RNAs as potential blood-based markers for early stage breast cancer detection[J].PLoS One，2012，7(1):e29770.

[8]Mar-Aguilar F,Mendoza-Ramírez JA,Malagón-Santiago I,et al.Serum circulating microRNA profiling for identification of potential breast cancer biomarkers[J].Dis Markers，2013，34(3):163-169.

[9]Si H,Sun X,Chen Y,et al.Circulating microRNA-92a and microRNA-21 as novel minimally invasive biomarkers for primary breast cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，2013，139(2):223-229.

[10]Zhao Y,Li C,Wang M,et al.Decrease of miR-202-3p Expression,a Novel Tumor Suppressor,in Gastric Cancer[J].PLoS One，2013，8(7):e69756.

[11]Hajian-Tilaki K.Receiver Operating Characteristic (ROC) Curve Analysis for Medical Diagnostic Test Evaluation[J].Caspian J Intern Med，2013，4 (2):627-635.

[12]Li A,Yu J,Kim H,et al.MicroRNA array analysis finds elevated serum miR-1290 accurately distinguishes patients with Low-stage pancreatic cancer from healthy and disease controls[J].Clin Cancer Res，2013,19(13):3600-3610.

[13]Vecchione A,Belletti B,Lovat F,et al.A microRNA signature defines chemoresistance in ovarian cancer through modulation of angiogenesis[J].Proc Natl Acad Sci,2013，110(24):9845-9850.

[14]Sand M,Skrygan M,Sand D,et al.Comparative microarray analysis of microRNA expression profiles in primary cutaneous malignant melanoma,cutaneous malignant melanoma metastases,and benign melanocytic nevi[J].Cell Tissue Res,2013，351(1):85-98.

[15]Volinia S,Croce CM.Prognostic microRNA/mRNA signature from the integrated analysis of patients with invasive breast cancer[J].Proc Natl Acad Sci,2013，110(18):7413-7417.

[16]Sachdeva M,Zhu S,Wu F,et al.p53 represses c-Myc through induction of the tumor suppressor miR-145[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(9):3207-3212.

[17]Shao Y,Qu Y,Dang S,et al.MiR-145 inhibits oral squamous cell carcinoma (OSCC) cell growth by targeting c-Myc and Cdk6[J].Cancer Cell Int，2013，13(1):51-56.

Research of circulating miR-145 and miR-484 in the diagnosis of breast cancer*

HUANGYuan-shuai1,ZHOUWei-xin2,LUOBin-rui2,GUOTian-hong2

(1.DepartmentofTransfusion,theFirstAffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.GraduateSchoolofSichuanMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the expression changes of miRNAs in the plasma of patients with breast cancer and to evaluate their significance,so as to find new biomarkers for the detection of breast cancer.Methods Plasma miRNA levels of 30 cases of patients with breast cancer and 20 cases of healthy controls in training group were measured by qRT-PCR.The diagnosis values of the candidate miRNAs were validated by blind method in test group (including 20 cases of patients with breast cancer and 20 cases of healthy controls).Results In training group,there were 6 differentially expressed miRNAs (P<0.05),in which miR-145 and miR-451 expressed significantly different from the other 4 miRNAs (P<0.05).The result of blind validation showed that a combination of miR-145 and miR-484 could be effective in the differential diagnosis between patients with breast cancer and healthy controls.And the AUC,sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of combination detection were 0.965,91.3% (95%CI85.2%-95.4%),90.8%(95%CI83.7%-93.6%),91.0% and 91.0%,respectively.Conclusion Plasma miR-145 and miR-484 could be potential specific biomarkers for breast cancer screening.

breast cancer; miR-145; miR-484; ROC curve; sensitivity

四川省衛(wèi)生廳課題資助項(xiàng)目(120336)。

黃遠(yuǎn)帥，男，博士，副研究員，主要從事microRNA與疾病關(guān)系的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.005

A

1672-9455(2015)24-3623-03

2015-07-20

2015-09-15)