王彥安，邱松山 ，王云芳，姜翠翠

(1．江蘇科技大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212000;

2．廣東石油化工學(xué)院果蔬加工與貯藏工程中心，廣東茂名525000)

山楂(Crataegus spp．)是薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科山楂屬植物，果實(shí)中主要含有黃酮類、低聚黃烷類、有機(jī)酸類、微量元素和有機(jī)胺類等活性成分［1］。研究表明，山楂具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗菌等多種生理功能［2－4］。目前國內(nèi)外山楂系列加工產(chǎn)品主要有罐頭、糖制品、飲料及山楂糕、山楂片等，由于山楂鮮食味道酸澀，山楂飲料及發(fā)酵類產(chǎn)品較少［5］。近年來，各種果醋飲品的研究受到越來越多的重視，草莓醋［6］、柿子醋［7］、柑橘醋［8］等各種果醋飲品不斷投入研發(fā)并投放市場。目前對山楂醋的研究［9－10］較少，市場上山楂果醋的品種也比較少，因此深加工發(fā)酵制備山楂果醋產(chǎn)品，使山楂果醋兼有食醋和山楂的保健功能，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。筆者以山楂為材料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化山楂醋的發(fā)酵工藝，解決山楂鮮果酸澀影響山楂醋品質(zhì)的問題，獲得營養(yǎng)、風(fēng)味、口感和色澤俱佳的山楂果醋，從而為山楂果醋的進(jìn)一步工業(yè)應(yīng)用提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 原料及試劑。新鮮山楂由廣東茂名信宜綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供，采摘當(dāng)天運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室，分選清洗備用;高活性干酵母，安琪酵母有限公司產(chǎn)品;醋酸菌(滬釀1．01)，廣東石油化工學(xué)院果蔬加工與貯藏工程中心實(shí)驗(yàn)室保存菌種;蔗糖為市售一級，葡萄糖、酵母膏為生化試劑;其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1．1．2 儀器與設(shè)備。RX-700α糖度計(jì)，日本愛宕科學(xué)儀器有限公司;DA-650臺式電子酒精度計(jì)，日本京都電子公司;DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，深圳三利儀器;80-2電動離心機(jī)，常州澳華儀器有限公司;PHS-3D型pH儀，上海儀電科學(xué)儀器有限公司。

1．2 操作方法

1．2．1生產(chǎn)工藝。山楂→去核→打漿→酶解→澄清過濾→調(diào)糖與pH→巴氏殺菌→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→過濾→調(diào)配→灌裝→巴氏滅菌→檢測→成品。

1．2．2 酵母活化。參考文獻(xiàn)［11］的方法，稱取3．0 g安琪活性干酵母，35～38℃條件下6%的糖水復(fù)水30 min，然后32℃條件下活化2 h備用。

1．2．3 醋酸菌種活化培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)［12］配制酵母膏1%、葡萄糖1%、碳酸鈣1%的醋酸菌活化培養(yǎng)基，加熱溶解、滅菌，冷卻后加入2%的95%乙醇。無菌條件下將醋酸菌種接入醋酸菌活化培養(yǎng)基200 ml/1 000 ml三角瓶中，32℃恒溫培養(yǎng)24 h，備用。

1．2．4 酶解。成熟完好的山楂清洗去核后與涼開水按質(zhì)量比1∶4 g/ml混合打漿榨汁，加熱至90℃保持10 min。冷卻后添加果汁液總量1%的果膠酶和1%的纖維素酶，45℃水浴酶解3 h。過濾后分裝于250 ml三角瓶中80℃巴氏滅菌10 min。

1．2．5 酒精發(fā)酵。參考文獻(xiàn)［13－14］經(jīng)滅菌的果汁接種5%的酵母活化液，糖度調(diào)至18%，pH為3．5，溫度保持30℃進(jìn)行酒精發(fā)酵，定期測定酒精度變化，酒精度不再變化時停止發(fā)酵，此時發(fā)酵液的酒精度為7．3% ～7．4%。

1．2．6 醋酸發(fā)酵。發(fā)酵后的酒液中酒精度調(diào)至4% ～12%，按接種量為6%～14%接種醋酸菌活化液，溫度控制在26～34℃的范圍內(nèi)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。單因素試驗(yàn)中，初始酒精度分別為4%、6%、8%、10%、12%，接種量分別為6%、8%、10%、12%、14%，發(fā)酵溫度分別為 26、28、30、32、34 ℃。

1．2．7 調(diào)配與滅菌。以硅藻土為過濾介質(zhì)，攪拌、靜置、抽濾，直至形成0．5～1．0 cm的濾層且無明顯渾濁時，收集濾液，測定生成醋酸和可溶性固形物的含量，并用山楂果汁、蜂蜜、白糖調(diào)配成口感良好、風(fēng)味獨(dú)特的山楂果醋飲料，巴氏滅菌后靜置陳釀一段時間［15］，經(jīng)檢驗(yàn)合格即為成品。

1．2．8 醋酸發(fā)酵試驗(yàn)優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的優(yōu)化發(fā)酵條件，采用Box-Behnken方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取接種量、初始酒精度、發(fā)酵溫度作為考察因素，以+1、0、－1代表高、中、低水平，以發(fā)酵后山楂果醋的產(chǎn)酸量為響應(yīng)值(Y，g/L)，設(shè)計(jì)3因素3水平共15個試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平

1．3 測定方法 pH采用PHS-3D型pH儀測定;可溶性固形物的含量采用RX-700α糖度計(jì)測定;酒精度采用DA-650臺式電子酒精計(jì)測定;醋酸含量采用NaOH滴定法測定;感官質(zhì)量采用感官評定法;還原糖的含量采用直接滴定法［16］測定;VC的含量采用2，6-二氯靛酚法測定;細(xì)菌總數(shù)采用GB/T4789．2－2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》規(guī)定的方法測定;大腸菌群采用GB/T4789．3－2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》規(guī)定的方法測定。

1．4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，Design-Expert 8．06軟件進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)優(yōu)化處理。

2 結(jié)果與分析

2．1 醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2．1．1 醋酸發(fā)酵中初始酒精度的影響。由圖1可知，產(chǎn)酸量隨著初始酒精度的升高而增大，當(dāng)初始酒精度為8%時產(chǎn)酸量達(dá)到最大，之后初始酒精度升高產(chǎn)酸量反而緩慢下降。初始酒精度為8%時，發(fā)酵液的產(chǎn)酸量是51．40 g/L，因此選擇發(fā)酵初始酒精度為8%。酒精度太低或太高都會限制醋酸菌的生長繁殖從而抑制醋酸發(fā)酵。

2．1．2 醋酸發(fā)酵中接種量的影響。由圖2可知，產(chǎn)酸量隨著接種量的增加而增大，當(dāng)接種量為10%時產(chǎn)酸量達(dá)到最大，之后接種量升高產(chǎn)酸量反而緩慢下降。接種量為10%時，發(fā)酵液的產(chǎn)酸量是52．30 g/L，因此選擇接種量為10%。醋酸菌接種太多使菌種生長受到限制，而接種太少則導(dǎo)致菌種生長過盛從而抑制醋酸發(fā)酵。

2．1．3 醋酸發(fā)酵中發(fā)酵溫度的影響。由圖3可知，產(chǎn)酸量隨著發(fā)酵溫度的增加而增大，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時產(chǎn)酸量達(dá)到最大，之后發(fā)酵溫度升高產(chǎn)酸量反而緩慢下降。發(fā)酵溫度為30℃時，發(fā)酵液的產(chǎn)酸量是51．90 g/L，因此選擇發(fā)酵溫度為30℃。

2．2 醋酸發(fā)酵的響應(yīng)面試驗(yàn) 醋酸發(fā)酵的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。采用Design-Expert軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到響應(yīng)值為Y值(產(chǎn)酸量，g/L)，自變量為接種量(X1，%)、初始酒精度(X2，%)、發(fā)酵溫度(X3，℃)的多元二次回歸方程:Y= －819．121 25+22．042 92 ×X1+23．145 56

回歸模型方差分析顯示，F(xiàn)模型=43．98，P模型=0．000 3＊＊;

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果分析

2．2．1 響應(yīng)面的交互效應(yīng)分析。由圖4(a)可知，接種量固定時，初始酒精度的升高使產(chǎn)酸量先增加后下降，隨著接種量的變化，初始酒精度對產(chǎn)酸量的影響發(fā)生較大變化;初始酒精度固定時，接種量的增加使產(chǎn)酸量先增加后下降，隨著初始酒精度的變化，接種量對產(chǎn)酸量的影響變化較大。因此接種量與初始酒精度的交互作用對產(chǎn)酸量的影響極顯著，這與方差分析中X1X2的交互效應(yīng)極顯著一致。

由圖4(b)可知，發(fā)酵溫度固定時，產(chǎn)酸量隨著接種量的增加先增加再下降，隨著發(fā)酵溫度的變化，接種量對產(chǎn)酸量的影響趨勢保持一致;接種量固定量，發(fā)酵溫度的升高使產(chǎn)酸量先增大后下降，隨著接種量的變化，發(fā)酵溫度對產(chǎn)酸量的影響趨勢保持一致。因此接種量與溫度的交互效應(yīng)對產(chǎn)酸量的影響不顯著，這與方差分析中X1X3的交互效應(yīng)不顯著一致。

由圖4(c)可知，發(fā)酵溫度固定時，初始酒精度的升高使產(chǎn)酸量呈先增加后下降的趨勢，隨著發(fā)酵溫度的變化，初始酒精度對產(chǎn)酸量的影響趨勢不變;初始酒精度固定時，發(fā)酵溫度的升高使醋酸產(chǎn)量先增加后減小，隨著初始酒精度的變化，發(fā)酵溫度影響產(chǎn)酸量的趨勢保持一致?？梢?，初始酒精度與發(fā)酵溫度的交互作用對產(chǎn)酸量的影響不顯著，這與方差分析中X2X3的交互效應(yīng)不顯著一致。

2．2．2 響應(yīng)面模型驗(yàn)證。采用Design-Expert軟件優(yōu)化分析試驗(yàn)結(jié)果，山楂醋發(fā)酵試驗(yàn)的最佳工藝參數(shù)為:接種量10．01%、初始酒精度7．38%、發(fā)酵溫度為29．74 ℃時，理論產(chǎn)酸量52．05 g/L，為了便于試驗(yàn)操作，山楂醋發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)簡化為:接種量10%、初始酒精度7%、發(fā)酵溫度為30℃，該條件下山楂醋的理論產(chǎn)酸量為51．77 g/L。根據(jù)優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件(接種量10%、初始酒精度7%、發(fā)酵溫度為30℃)進(jìn)行3次重復(fù)檢驗(yàn)試驗(yàn)，測得果醋產(chǎn)酸量均值51．76 g/L，與理論值(51．77 g/L)的相對誤差小，表明響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)獲得的發(fā)酵工藝條件可信。

采用此工藝得到的山楂果醋產(chǎn)品呈亮紅色，無懸浮物和沉淀，酸甜柔和，具有濃郁的山楂果香?？偹?以醋酸計(jì)):51．80 g/L;可溶性固形物:7．10%;還原糖(以葡萄糖計(jì)):2．75 g/L;VC:869．0 mg/L。細(xì)菌總數(shù) ＜100 CFU/ml;大腸菌群、致病菌:未檢出。

3 結(jié)論

該研究確定了最佳的山楂醋發(fā)酵工藝，醋酸發(fā)酵最佳工藝條件為:接種量10%、初始酒精度7%、發(fā)酵溫度為30℃，該工藝下醋酸產(chǎn)量51．77 g/L。研究采用Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化果醋發(fā)酵，建立關(guān)于接種量、初始酒精度、發(fā)酵溫度對產(chǎn)酸量的回歸方程:Y=-819．121 25+22．042 92×X1+23．145 56 ×X2+45．423 75 × X3-0．469 17 × X1× X2-0．039 375 × X1× X3+0．077 500 ×X2×X3-0．869 27 ×X12-1．405 37 × X22-0．766 77×X32。響應(yīng)面試驗(yàn)中單因素作用和雙因素交互作用對果醋產(chǎn)量的影響體現(xiàn)為:接種量與初始酒精度的交互作用對醋酸的影響極顯著(P＜0．01)，接種量與發(fā)酵溫度的交互作用對醋酸的影響不顯著(P＞0．05)，初始酒精度與發(fā)酵溫度的交互作用對醋酸的影響不顯著(P＞0．05)。

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