段睿，劉正人，張浩

(1.荊門市第一人民醫(yī)院普通外科，湖北荊門448000；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，江西南昌330006)

Survivin siRNA對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞裸鼠移植瘤血管生成的影響

段睿1，劉正人2，張浩1

(1.荊門市第一人民醫(yī)院普通外科，湖北荊門448000；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，江西南昌330006)

目的探討凋亡抑制基因Survivin的小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株K1裸鼠移植瘤血管生成的影響。方法將表達(dá)特異性Survivin siRNA序列的質(zhì)粒載體，與表達(dá)無關(guān)序列siRNA的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染K1細(xì)胞；G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)Survivin siRNA和表達(dá)無關(guān)序列siRNA的K1細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染的K1細(xì)胞分別注射于裸鼠皮下，觀察三組移植瘤的生長速度。SP免疫組化法檢測各組移植瘤中的微血管密度(MVD)。結(jié)果Survivin siRNA組比無關(guān)序列siRNA組腫瘤平均質(zhì)量減少56%，比未轉(zhuǎn)染組腫瘤平均質(zhì)量減少63%；Survivin siRNA組MVD明顯低于無關(guān)序列siRNA組及未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)；無關(guān)序列siRNA組與未轉(zhuǎn)染組MVD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論Survivin siRNA可抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1裸鼠移植瘤的微血管生成及腫瘤生長。

Survivin；siRNA；甲狀腺癌；血管生成

甲狀腺癌是一種常見的惡性腫瘤，超過90%的患者為分化型甲狀腺癌(Differentiated thyroid carcinoma，DTC)，處于進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的晚期DTC尚缺乏有效的治療方法。目前的研究表明凋亡抑制蛋白Survivin在DTC組織中表達(dá)上調(diào)上并與微血管生成關(guān)系密切[1]。我們寄希望于靶向構(gòu)建Survivin的SiRNA載體能減少甲狀腺癌腫瘤組織的微血管生成，以抑制腫瘤的生長。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、動(dòng)物和試劑甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株K1購自歐洲細(xì)胞庫；4～6周齡Ba1b?c雌性裸鼠購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；DMEM培養(yǎng)基購于GIBCO公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、胎牛血清(FCS)購于Invitrogen公司；抗生素G418購于Merck公司。PcDNA3質(zhì)粒購于武漢晶賽公司；CD34鼠抗人單克隆抗體、SP免疫組織化學(xué)試劑盒購于北京中山生物有限公司；含Survivin siRNA的PcDNA3-siRNA質(zhì)粒由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心構(gòu)建。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染K1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染前調(diào)整細(xì)胞密度2×105/孔，培養(yǎng)過夜使得細(xì)胞融合率為50%～60%。按2.5μg質(zhì)粒比4μl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectam ine 2000的比例混合，轉(zhuǎn)染過程參照Lipofectam ine 2000試劑說明書。

1.2.2 篩選穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后更換含G418的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)G418濃度至1 mg/ml，培養(yǎng)21 d后在熒光電子顯微鏡下選取表達(dá)綠熒光蛋白的細(xì)胞克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)備用。

1.2.3 移植腫瘤模型雌性裸鼠隨機(jī)分為未轉(zhuǎn)染組、無關(guān)序列siRNA組、Survivin siRNA組，每組10只。每只裸鼠腋部皮下注射約0.1 ml PBS懸浮的細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為5.0×106/ml，分別為未轉(zhuǎn)染的K1細(xì)胞、表達(dá)無關(guān)序列siRNA的K1細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)Survivin siRNA的K1細(xì)胞。10周后頸椎脫臼法處死裸鼠，完整切除腫塊，物理天平測量腫瘤質(zhì)量后置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片。

1.2.4 腫瘤組織微血管密度(MVD)的檢測按SP試劑說明書以CD34標(biāo)記MVD，一抗采用CD34鼠抗人單克隆抗體，以染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞叢作為1個(gè)微血管計(jì)數(shù)。先在40倍顯微鏡下觀察整張切片，確定切片中3個(gè)血管密度最高區(qū)域，然后在200倍鏡下計(jì)數(shù)該3個(gè)區(qū)域內(nèi)染色的微血管數(shù)目，取其平均值作為該標(biāo)本的MVD。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，并選用兩獨(dú)立樣本比較的t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

裸鼠腋部皮下注射K1細(xì)胞后全部成瘤，第10周末三組裸鼠的皮下移植腫瘤大小差異顯著，Survivin siRN組比無關(guān)序列siRNA組腫瘤平均質(zhì)量減少56%，比未轉(zhuǎn)染組腫瘤平均質(zhì)量減少63%，見表1。

表1 三組裸鼠皮下移植腫瘤生長及微血管生成的比較(±s)

注：a與b兩組比較，t=1.571，P=0.134；a與c兩組比較，t=10.342，P= 0.000；b與c兩組比較，t=10.226，P=0.000。

?

3 討論

RNA干擾(RNAi)是將雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞引起特異基因mRNA降解的一種細(xì)胞反應(yīng)過程，是轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種技術(shù)，具有高效性、特異性以及多功能性的優(yōu)點(diǎn)[2]。小干擾RNA(siRNA)是RNAi的效應(yīng)分子，自從Elbashir等[3]的研究發(fā)現(xiàn)siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能降解同源序列靶基因的mRNA以來，體外合成siRNA為哺乳動(dòng)物基因治療開創(chuàng)了新的道路。

Survivin屬于凋亡抑制蛋白家族成員，在分化型甲狀腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤微血管生成關(guān)系密切，在分化型甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，有望成為甲狀腺癌診斷和治療的新靶點(diǎn)[4-6]。同時(shí)由于Survivin特異性地表達(dá)于腫瘤組織，在正常成人組織幾乎不表達(dá)，使得Survivin的靶向治療具有良好特異性及安全性。

富凱等[7]的研究表明：Survivin siRNA能夠抑制腺樣囊性癌瘤體生長，并在體內(nèi)通過抑制腺樣囊性癌VEGF表達(dá)有效減少腫瘤血管生成。我們將穩(wěn)定表達(dá)Survivin siRNA和表達(dá)無關(guān)序列siRNA的K1細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染的K1細(xì)胞分別注射于裸鼠皮下，觀察三組移植瘤的生長速度；SP免疫組化法檢測各組移植瘤中的微血管密度(MVD)。結(jié)果提示：Survivin siRNA組比無關(guān)序列SiRNA組腫瘤平均質(zhì)量減少56%，比未轉(zhuǎn)染組腫瘤平均質(zhì)量減少63%，說明Survivin siRNA可抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1裸鼠移植瘤的生長。Survivin siRNA組較其他兩組MVD值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；未轉(zhuǎn)染組與無關(guān)序列SiRNA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明Survivin siRNA可抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1裸鼠移植瘤的微血管生成。本結(jié)果提示Survivin siRNA可能通過抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1裸鼠移植瘤的微血管生成從而抑制腫瘤的生長。

由于Survivin在腫瘤的生長及血管生成方面發(fā)揮著重要的作用，提示survivin siRNA在甲狀腺乳頭狀癌的治療中具有重要的潛在價(jià)值，本研究可以為臨床上采用以Survivin為靶點(diǎn)基因治療提供一個(gè)理論證據(jù)。

[1]馬靜,李曉江,隋軍,等.survivin在甲狀腺癌中的表達(dá)及與微血管生成的關(guān)系[J].腫瘤防治研究,2010,37(10):1149-1151.

[2]Aagaard L,Rossi JJ.RNAi therapeutics:principles,prospects and challenges[J].Adv Drug Deliv Rev,2007,59(223):75-86.

[3]Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells [J].Nature,2001,411(6836):494-498.

[4]吳澤建,謝楚平,蔣基令,等.甲狀腺癌中Survivin與VEGF因子的表達(dá)及其臨床意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2011,21(10): 1158-1160.

[5]盧秀波,安兆峰,王慶兆,等.Survivin和c-myc在分化型甲狀腺癌中的表達(dá)及臨床意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2004,21(6): 705-706.

[6]Chen Z,Liu N,Zhu G,et al.Targeting of the anti-apoptotic gene survivin in human thyroid carcinoma[J].Int J Mol Med,2012,30 (03):465-472.

[7]富凱,楊軍,汪欣,等.Survivin siRNA抑制人腺樣囊性癌ACC 22細(xì)胞移植瘤血管生成[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32 (16):1750-1753.

Effects of survivin siRNA on angiogenesis of papillary thyroid carcinoma xenografts in nude mice.

DUAN Rui1, LIU Zheng-ren2,ZHANG Hao1.1.Department of General Surgery,the First People's Hospital of Jingmen City,Jingmen 448000,Hubei,CHINA;2.Department of General Surgery,the first Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,Jiangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of survivin small interfering RNA(siRNA)on angiogenesis of papillary thyroid carcinoma K1 cell xenografts in nude mice.MethodsK1 cells were transfected through Lipofectamine 2000 and selected by G418.K1 cells transfected with survivin siRNA-plasmid(survivin siRNA group),K1 cells transfected with non-silencing-plasmid(non-silencing siRNAgroup)and K1 cells without transfection(non-transfection group)were inoculated into nude mice,respectively.Microvessel density was measured by immunohistochemistry staining.ResultsThe mean tumor size of murine xenograft in survivin siRNAgroup was reduced by 56%and 63%compared with non-silencing siRNA group and control group,respectively.Microvessel density in survivin siRNA group were significantly decreased compared with non-silencing siRNA group and control group(P＜0.05),whereas no significant difference was noted between non-silencing siRNA group and control group(P＞0.05).ConclusionSurvivin siRNA can inhibit angiogenesis and growth in papillary thyroid carcinoma K1 cell xenografts.

Survivin;siRNA;Thyroid carcinoma;Angiogenesis

R-332

A

1003—6350（2015）01—0005—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0002

2014-04-07)

湖北省衛(wèi)生廳科研指導(dǎo)性項(xiàng)目(編號(hào)：JX4C36)

張浩。E-mail:431800zhanghao@sina.com