李德增+陳波

摘要：介紹了2014年諾貝爾化學獎，并以此為背景圍繞著如何突破衍射極限提高分辨率這一核心問題，通過衍射極限產(chǎn)生的原因、突破的途徑及新型顯微技術發(fā)展的歷程及特點等幾個方面展開闡述，以期更好地認識新型光學顯微技術在探索納米世界時的作用和意義。

關鍵詞：諾貝爾化學獎；衍射極限；瑞利判據(jù)；超分辨率；熒光顯微技術

文章編號：1005–6629（2015）1–0012–05 中圖分類號：G633.8 文獻標識碼：B

1 引言

2014年10月8日，2014年度諾貝爾化學獎揭曉，美國科學家埃里克·白茲格（Eric Betzig）、威廉姆·艾斯科·莫爾納爾（William E. Moerner）和德國科學家斯特凡·W·赫爾（Stefan W. Hell）三人獲獎，以表彰他們在超分辨率熒光顯微技術領域取得的成就。

長期以來，光學顯微鏡的分辨率被認為是有極限的，它不可能超過二分之一個光波長度，對于可見光波長而言，約200納米。1873年德國物理學家阿貝（E. Abbe）指出衍射極限是傳統(tǒng)光學顯微鏡存在最大分辨率的物理限制。然而，在熒光分子的幫助下，今年諾貝爾獎化學獎的幾位獲得者巧妙地繞開了這種限制，并突破了這一極限。他們劃時代的貢獻將傳統(tǒng)光學顯微鏡技術帶進了納米領域，使光學顯微鏡步入了納米時代。

根據(jù)納米熒光顯微技術，科學家實現(xiàn)了活體細胞中單個分子通路的可視化。他們能夠觀察到分子是如何在大腦神經(jīng)細胞之間生成神經(jīng)突觸；還可以追蹤帕金森病、阿爾茲海默癥和亨廷頓癥患者體內相關蛋白的累積情況等等。然而科學家在最小分子水平上對活體細胞細節(jié)進行研究時，卻受到了限制。由于今年三位諾獎得主的貢獻，我們可以利用突破衍射極限的光學顯微鏡對納米世界一探究竟。

這次獲獎的是兩項獨立的技術。第一項是Stefan Hell于2000年研制的受激發(fā)射損耗（STED）顯微技術。此項技術采用了兩束激光。一束負責激發(fā)熒光分子使其發(fā)光，另一束則負責抵消大部分熒光，只留下一塊納米大小體積的熒光區(qū)域。用該技術仔細掃描樣本，得出的圖像分辨率打破了Abbe提出的顯微分辨率極限。Eric Betzig和William Moerner分別獨立地進行研究，為第二種技術即單分子顯微技術打下了基礎。這種方法依賴于開關單個分子熒光的可能性。科學家對同一區(qū)域進行了多次“繪圖”，每次僅僅讓很少量的分散分子發(fā)光。將這些圖像疊加起來產(chǎn)生了密集的納米尺寸超分辨率圖像。2006年，Eric Betzig首次采用了這一技術[1]。

今天，超分辨納米顯微技術已被世界廣泛采用，新知識源源不斷地產(chǎn)生，造福著人類。利用超高分辨率顯微鏡，可以讓科學家們在分子水平上對活體細胞進行研究，如觀察活細胞內生物大分子與細胞器微小結構以及細胞功能如何在分子水平上進行表達及編碼，對于理解生命過程和疾病發(fā)生機理具有重要意義。

本文圍繞著如何突破分辨率極限這一核心問題，通過分辨率極限產(chǎn)生的原因、突破的途徑及新型顯微技術發(fā)展的歷程及特點等幾個方面展開闡述，以期更好地理解新型光學顯微技術在探索納米世界時的作用和意義。

2 衍射極限與瑞利判據(jù)

傳統(tǒng)（透鏡式、傳輸光）光學顯微鏡的有效放大倍率是有限的，它取決于成像的衍射極限。光在傳播過程中，遇到障礙物或小孔時，光將偏離直線傳播的途徑而繞到障礙物后面?zhèn)鞑?，即光的衍射現(xiàn)象。衍射效應使障礙物后空間的光強重新分布，使得一切幾何影界失去了明銳的邊緣。衍射極限是指一個理想物點經(jīng)光學系統(tǒng)成像，由于衍射的限制，系統(tǒng)所成的像不再是理想的幾何點像，而是得到形成明暗相間的衍射圖樣（夫朗和費衍射像）。許多成像光學儀器就是一個低通濾波器，物平面包含從低頻到高頻的信息，透鏡口徑限制了高頻信息通過，只許一定的低頻通過，因此，丟失了高頻信息的光束再合成，圖像的細節(jié)變模糊。這是顯微鏡分辨率受到限制的根本原因。因為一般光學系統(tǒng)的口徑都是圓形，大約有84%的光能量集中在中央亮斑，即愛里斑（Airydisk）（圖1a），這樣每個物點的像就是一個彌散斑。當兩個物點過于靠近，其彌散斑重疊在一起，就可能分辨不出是兩個物點的像，這樣就限制了系統(tǒng)的分辨率，這個斑越大，分辨率越低。這個限制是物理光學的限制，是光的衍射造成的，即光學系統(tǒng)中存在著一個分辨極限。

Abbe用衍射理論預言了分辨率極限的存在[2]，這個分辨極限通常采用瑞利（Rayleigh）提出的判據(jù)[3]：當一個愛里斑的中心與另一個愛里斑的第一級暗環(huán)重合時，兩個愛里斑像就可分辨或恰可分辨，如圖1b所示。如果兩個愛里斑的中心間距小于愛里斑的半徑（圖1c），兩個愛里斑像就不能分辨。對于顯微鏡物鏡，錐形光束聚焦的焦斑最小可分辨尺度設為CD，則：

3 突破衍射極限

阿貝推導的傳統(tǒng)光學顯微鏡成像中的衍射極限，與海森伯不確定性原理同為物理學中的兩大著名的物理極限定理。用海森伯原理可說明光子發(fā)射不確定性，因而也可說明限制傳統(tǒng)光學顯微鏡分辨極限的關鍵所在和突破光學顯微鏡分辨極限所要求的條件。

4 打破衍射極限：近場光學顯微技術

當光源照射到物體表面時，在物體表面的場分布可劃分為兩個區(qū)域：一部分是從近場區(qū)域至無窮遠稱為遠場；另一部分是物體表面小于一個波長（或λ/2）尺度范圍內的區(qū)域，稱為近場。近場光學之所以能突破衍射極限成像，其核心問題是依賴于對隱失波的探測，這是實現(xiàn)超分辨成像的關鍵。其原理是采用亞波長尺度的探針在距離樣品表面幾個納米的近場范圍進行掃描而將隱失場轉換成忠實地復制隱失場局域的劇烈變化的傳播場，并導向合適的遠端探測器進行分析。近場光學顯微鏡（NOM）可粗分為兩大類型：掃描近場光學顯微鏡（SNOM）和光子掃描隧道顯微鏡（PSTM）?；诮鼒龉鈱W技術的光學分辨率可以達到納米量級，這將為科學研究的諸多領域，尤其是納米科技的發(fā)展提供有力的操作、測量方法和儀器系統(tǒng)。

1928年，英國的辛格（Synge EH）[5]和1956年奧·基夫（Okeefe JA）先后獨自提出了概念設計。60年代，工作在微波區(qū)域的近場顯微鏡，由E. A. Ash和G. Nichols研制成功，在人類歷史上第一個制成了突破衍射極限的顯微鏡。1982年，瑞士蘇黎世IBM的G. Binning和H. Rohrer等[6]發(fā)明的掃描隧道顯微鏡（STM），在被應用到光學領域時，極大推動了近場光學顯微鏡的誕生和發(fā)展。1984年，瑞士蘇黎世IBM的D. W. Pohl等人[7]利用微孔徑作為微探針制成第一臺掃描近場光學顯微鏡，首次實現(xiàn)了可見光波段顯微鏡分辨極限的突破。1986年，美國康奈爾大學的E. Betzig等[8]制成改進的近場光學顯微鏡。1989年R. C. Reddick等人[9]研制成了另一類突破分辨率衍射極限的光學顯微鏡——光子掃描隧道顯微鏡（PSTM）。1991年，E. Betzig等人[10]對近場掃描光學顯微鏡進行重大技術改進。隨后，各種各樣的近場光學顯微鏡逐漸走向成功，開始應用于表面超精細結構的光學現(xiàn)象觀測校樣[11]。

5 繞開衍射極限：超分辨率熒光顯微技術

近場光學顯微技術實現(xiàn)了衍射極限的突破，但由于其制備工藝及觀察活細胞和細胞膜的動態(tài)變化過程中的限制，探索既具有亞微米甚至納米尺度的光學分辨本領，又可以連續(xù)監(jiān)測生物大分子和細胞器微小結構的演化，而并不影響生物體系的生物活性和新型超分辨顯微技術顯得尤為重要。近年來，隨著新型熒光分子探針的出現(xiàn)和成像方法的改進，可以在活細胞上看到納米尺度的蛋白質。這些技術上的進步勢必極大地推動生命科學的發(fā)展。

本年度諾貝爾化學獎即是對兩項獨立的超分辨率熒光顯微技術的肯定。在這里首先介紹單分子顯微技術。通過確定單個熒光分子位置的精度的提高，可以很容易超過光學分辨率的極限，達到納米級[12]。在此基礎上，人們開始測量一些熒光標記生物分子的納米級定位和運動。1981年，Barak和Webb[13]首先將單分子跟蹤技術引入到生命科學中，在成纖維細胞上跟蹤了一個熒光標記的低密度脂蛋白受體的動力學過程。2006年Eric Betzig[14]提出了光激活定位顯微技術（Photo Activated Localization Microscopy，PALM）的概念。應用單分子熒光成像的定位精度，結合這種熒光蛋白的發(fā)光特性，突破了光學分辨率的極限。如圖6所示，（A，A′）為未激活任何感光熒光蛋白分子（PA-FP）時；（B，B′）為用405nm的激光激活了4個熒光分子；（C，C′）為用488nm的激光觀察一段時間后漂白了第一輪激活的4個熒光分子；（D，D′）為第二輪重新激活的另外的幾個熒光分子；（E，E′）為兩輪激活的熒光分子總和組成的圖像；（F，F(xiàn)′）為E圖的局部放大。PALM顯微鏡的分辨率僅僅受限于單分子成像的定位精度，理論上來說可以達到1nm的數(shù)量級。2006年美國霍華德-休斯研究所的華裔科學家莊曉薇[15]實驗組開發(fā)出來一種類似于PALM的方法：隨機光學重構顯微技術（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM），推進了此領域的研究進展。

盡管單分子的定位精度可以達到納米級，但它并不能提高光學顯微鏡在分辨兩個或者多個點光源時的分辨率。不管是PALM還是STORM的超分辨率成像方法，其點擴散函數(shù)（Point-spread Function，PSF）成像仍然與傳統(tǒng)顯微成像一致。相對近場光學顯微技術來說，是一種繞過衍射極限的超分辨方法。

2000年，德國科學家Stefan Hell[16，17]開發(fā)了另一種超高分辨率顯微技術，其基本原理是通過物理過程來減少激發(fā)光的光斑大小，從而直接減少點擴散函數(shù)的半高寬來提高分辨率。當特定的熒光分子被比激發(fā)波長更長的激光照射時，可以被強行猝滅回到基準態(tài)[18]。利用這個特性，Hell等開發(fā)出了受激發(fā)射損耗顯微技術（Stimulated Emission Depletion，STED）。其基本的實驗過程如圖7所示，紫色代表的是激發(fā)激光，黃色代表的是用來受激發(fā)射損耗的激光，兩束激光經(jīng)過時間空間調制后同時照射在樣本上。由圖中可以看出，激發(fā)光光斑（紫色）經(jīng)STED激光（黃色）的調制后極大地減少了激發(fā)的熒光分子的光斑大小（綠色），其半高寬可以達到66nm，運用該技術進行樣品觀察探測，即可得出突破衍射極限的超分辨率圖像。

6 結語

人們對于未知世界的探索是無止境的。起初，人類關于周圍世界的觀念局限在用肉眼，或者靠手持透鏡幫助肉眼所看到的東西。然后，人類的認識并不局限于此，有太多未知世界的奧秘激勵著人們去探求，四季輪回，斗轉星移，對人類來說，都是那么神秘。當伽利略于幾百年前第一次把自制的望遠鏡對向浩瀚的太空，他的腦海里一定滿是震驚，一個新的世界展現(xiàn)在他的視野里，也把人類的目光延伸到了數(shù)以光年計的宏觀領域。而同時人類也把目光投向了另一個未知的世界，一個尺寸小于人眼所能辨別的領域——微觀領域。這要歸功于另一個偉大的發(fā)明——顯微鏡——它同樣在人類的視野里展現(xiàn)了一個全新的世界，第一次看到了數(shù)以百計的“新的”微小動物和植物，以及從人體到植物纖維等各種東西的內部構造，至今仍令人著迷。后來，慢慢地發(fā)現(xiàn)通過普通的光學顯微鏡所能分辨的尺寸有著一個極限，無論如何設計這個極限都是無法逾越的。這時，阿貝給出了極限存在的科學解釋，瑞利給出了判據(jù)，并進而激發(fā)了人們去突破這個極限。分辨率有著質的飛躍的是用電子和離子作信息載體的顯微鏡，如掃描電子顯微鏡、掃描隧道顯微鏡和場離子顯微鏡等。雖然分辨率在提高，但卻未真正地突破衍射極限。直到充分認識到近場隱失波的物理意義，并制備出近場顯微鏡，才真正地突破了衍射極限。隨之，各種各樣的近場顯微技術出現(xiàn)并探索著納米尺度的微小世界。而在認識生命相關的生物動態(tài)變化過程中，激發(fā)人們去尋求一種兼具微尺度要求及生物活性的新的顯微技術。超分辨率顯微鏡成像技術的出現(xiàn)、應用和進一步完善，將使得科學家實時動態(tài)觀察生物有機體內的生化反應過程成為現(xiàn)實，為深刻認識復雜生命現(xiàn)象的本質打開了一扇窗。人類探索的步伐定會繼續(xù)進行下去，在更微觀的世界里去更好地認識事物的本質、變化規(guī)律及作用機制，進而根據(jù)認識的規(guī)律去設計特殊功能的納米體系，為人類的發(fā)展做出更大貢獻。

參考文獻：

[1] 參考諾貝爾官方網(wǎng)站（http：//www.nobelprize.org）及媒體相關報道內容.

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