王俏琦 章元兵 張子恒 周爽 劉冀瓏

2020年10月7日，2020年度諾貝爾化學(xué)獎授予德國馬克斯·普朗克病原學(xué)研究室的生物化學(xué)家沙彭蒂耶（E. Charpentier）和美國加州大學(xué)伯克利分校的生物化學(xué)家杜德納（J. A. Doudna），以表彰兩人“開發(fā)了一種基因組編輯方法”。她們是第6位和第7位獲得諾貝爾化學(xué)獎的女性。

沙彭蒂耶1968年出生于法國，1995年在巴黎巴斯德研究所獲得博士學(xué)位，過去20年在5個不同國家9所不同大學(xué)工作過，已獲得10項久負(fù)盛名的科學(xué)獎項，目前是德國馬克斯·普朗克病原學(xué)研究所所長。杜德納1964年出生于美國，1989年從哈佛醫(yī)學(xué)院畢業(yè)獲得博士學(xué)位，曾在2016年獲得世界杰出女科學(xué)家成就獎，目前是加州大學(xué)伯克利分校教授、霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員。

當(dāng)細(xì)菌和病毒入侵人體，人體的免疫系統(tǒng)就會反擊。同樣，細(xì)菌在漫長的進化過程中，也形成了一套防御病毒入侵的“免疫系統(tǒng)”——CRISPR/Cas系統(tǒng)，CRISPR是成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的縮寫，Cas是CRISPR相關(guān)（CRISPRassociated）基因的縮寫。病毒侵入細(xì)菌后把自身的基因整合到細(xì)菌基因組中，利用細(xì)菌細(xì)胞復(fù)制自己的基因，而細(xì)菌的CRISPR/Cas系統(tǒng)可以識別病毒的基因，并將其從自己的基因組上切除。

CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)就是由一段相當(dāng)于GPS可精準(zhǔn)定位基因組目的序列的向?qū)NA，將“上帝的手術(shù)刀”核酸內(nèi)切酶Cas9指引到特定目的序列處，由核酸內(nèi)切酶Cas9將基因組DNA切出缺口，然后利用機體自身的DNA雙鏈斷裂修復(fù)機制，產(chǎn)生插入（或）刪除的突變來實現(xiàn)基因敲除，或者利用外源模板序列進行同源重組修復(fù)。

沙彭蒂耶發(fā)現(xiàn)了一種之前未知的分子——tracrRNA，而它則是細(xì)菌古老免疫系統(tǒng)CRISPR/Cas的一部分，它可通過裂解病毒DNA來對付病毒的入侵。沙彭蒂耶與杜德納合作，又成功地再造了細(xì)菌的基因剪刀，簡化了剪刀的分子組成，并對基因剪刀重新編程，使其可以被控制，可以在一個預(yù)定位置切斷DNA分子。

利用CRISPR/Cas9技術(shù)可極其精確地改造動物、植物和微生物的DNA，它對生命科學(xué)產(chǎn)生了革命性的影響。比如，構(gòu)建動物疾病模型，為癌癥治療提供新思路，使治愈遺傳性疾病的夢想成為現(xiàn)實，甚至提供了創(chuàng)造新物種的可能性。

CRISPR研究的歷程

一般認(rèn)為CRISPR系統(tǒng)是在1987年被首次發(fā)現(xiàn)的。日本納卡塔（A. Nakata）研究組在分析大腸桿菌基因組中與磷酸鹽代謝相關(guān)基因的過程中，偶然發(fā)現(xiàn)了位于堿性磷酸酶同工酶（iap）基因的3’端有一段長度為29個堿基對的短序列會重復(fù)出現(xiàn)，當(dāng)時他們對這個特征序列本身并沒給予過多關(guān)注，甚至論文里也僅僅是提到這一序列，但并未將其命名[1]。

CRISPR系統(tǒng)被真正作為研究對象是在1993年。莫伊察（F. Mojica）在西班牙阿里坎特大學(xué)攻讀博士學(xué)位期間發(fā)現(xiàn)：地中海富鹽菌（Haloferax mediterranei），一種在西班牙圣波拉港口被發(fā)現(xiàn)的極度耐鹽的古菌，其限制性內(nèi)切酶會受到培養(yǎng)基中鹽濃度的影響，而以不同方式切割自身的基因組。在研究這種現(xiàn)象時，莫伊察發(fā)現(xiàn)了一段與微生物中已知序列都不同的長約30個堿基的重復(fù)的近似回文的序列，這個固定序列之間由大約36個堿基間隔開。之后，莫伊察又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，在與地中海富鹽菌親緣關(guān)系近的沃氏富鹽菌（Haloferax volcanii），以及與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的嗜鹽古菌中，也有類似的保守序列。很快，莫伊察意識到這段序列與1987年納卡塔研究組發(fā)表的文獻中的細(xì)菌特征序列之間的聯(lián)系，他認(rèn)為在不同種微生物中，都存在這樣一段序列，并且它們發(fā)揮著重要的作用，最終將其命名為短規(guī)律性間隔重復(fù)序列（short regularly spaced repeats）。到2000年，莫伊察已在20種微生物中發(fā)現(xiàn)這段重復(fù)序列。之后兩年內(nèi)，研究者們迅速將對這個基因座的研究拓寬到與這段序列有關(guān)的特定基因。2002年，詹森（R. Jansen）實驗室發(fā)表論文，首次將這段序列命名為CRISPR，將與其相關(guān)的特定基因命名為Cas基因。

但是，這段特別序列的功能在很長一段時間里一直沒有弄清楚。2003年莫伊察作為CRISPR領(lǐng)域的新領(lǐng)導(dǎo)者，開始將注意力放在將此重復(fù)序列隔開的間隔子（spacer）上。由于間隔子序列具有種內(nèi)保守的特點，莫伊察將不同的間隔子序列進行大量比對，最終發(fā)現(xiàn)有一種間隔子的序列與感染大腸桿菌的P1噬菌體基因組某段序列相吻合。此后，他又通過一系列比對發(fā)現(xiàn)，CRISPR中的間隔子序列來自外源噬菌體或者質(zhì)粒。值得注意的是，博洛廷（A. Bolotin）首次提出CRISPR基因座會通過反義RNA來抑制噬菌體基因的表達，雖然之后這個假說被證實是錯誤的，但它率先賦予了CRISPR在免疫學(xué)方面的意義。

CRISPR在細(xì)菌免疫系統(tǒng)中的作用是由霍瓦特（P. Horvath）揭示的。在克服困擾工業(yè)生產(chǎn)的噬菌體感染時，霍瓦特致力于開發(fā)基于DNA的菌株鑒定技術(shù)，并使用CRISPR對菌株進行基因分型。2004年，他同樣注意到間隔子與細(xì)菌對噬菌體抗性之間的聯(lián)系。2005年，霍瓦特及其同事試圖證實CRISPR是一種細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。2007年，霍瓦特描述了一種嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）在被噬菌體入侵后，鏈球菌基因組內(nèi)會整合進來自噬菌體基因組的間隔子序列，當(dāng)該鏈球菌再次被同樣的噬菌體入侵時，鏈球菌就可產(chǎn)生抗性，而如果改變這段間隔子序列，則會影響該鏈球菌的抗性。同時還發(fā)現(xiàn)，鏈球菌獲得這種抗性需要Cas7蛋白的參與（但維持抗性不需要Cas7蛋白），而Cas9蛋白——其序列包含兩種類型核酸酶結(jié)構(gòu)域（HNH和RuvC）——及其產(chǎn)物，可能會切割核酸，它對抵抗噬菌體是必需的，所以，Cas9蛋白被認(rèn)為是細(xì)菌免疫系統(tǒng)的活性成分。

科學(xué)家們很快開始進一步研究CRISPR/Cas的作用機理，第一個關(guān)鍵研究來自范德歐斯特（J. van der Oost）團隊。他們通過將一種大腸桿菌的CRISPR系統(tǒng)插入另一種缺乏內(nèi)源性CRISPR系統(tǒng)的大腸桿菌菌株中，從生化角度驗證了該系統(tǒng)是由5種Cas蛋白組成的復(fù)合物，并將其命名為級聯(lián)復(fù)合物（cascade）。然后通過依次敲除級聯(lián)復(fù)合物每個組分，證明級聯(lián)復(fù)合物對于切割從CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄而來的前體CRISPR RNA（crRNA）是必要的，最終切割產(chǎn)物是具有61個堿基的crRNA，它由上一個重復(fù)序列最后8個堿基、完整間隔子序列和下一個重復(fù)序列的起始部分組成，可將Cas蛋白引導(dǎo)至目的DNA上。隨后，范德歐斯特通過分別構(gòu)建反義方向（與mRNA和編碼鏈DNA的序列互補）和順義方向（僅與另一條DNA互補）兩種CRISPR序列，使得其可以靶向到λ噬菌體的必需基因上。他們的研究結(jié)果暗示了CRISPR不是作用于RNA，而是作用于DNA。

同年，瑪拉菲尼（L. Marraffini）和松特海默爾（E. Sontheimer）證實了CRISPR的作用靶標(biāo)是DNA。兩年后，即2010年，穆瓦諾（S. Moineau）等人發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9在目的DNA的原間隔子鄰近基序（protospacer adjacent motif， PAM）上游3個堿基對處進行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂缺口（double-strand break， DSB）。

而與此同時，沙彭蒂耶正著力于研究病原體化膿性鏈球菌是如何實現(xiàn)基因調(diào)控的。2011年，沙彭蒂耶等對鏈球菌內(nèi)大量小RNA進行定位研究，發(fā)現(xiàn)其堿基序列非常接近已揭示的CRISPR基因座，一系列研究證實，一種未知的RNA分子對于CRISPR系統(tǒng)的功能實現(xiàn)具有重要作用，遂將其命名為反式激活的CRISPR RNA，簡稱tracrRNA（trans-activating crRNA），tracrRNA通過與crRNA形成雙鏈體，將Cas9引導(dǎo)至靶標(biāo)。

由于之前從未接觸過CRISPR系統(tǒng)，沙彭蒂耶在一次參加在波多黎各召開的會議上，遇到來自美國加州大學(xué)伯克利分校的杜德納博士，沙彭蒂耶邀請杜德納進行合作研究，杜德納欣然接受。杜德納的同事們通過數(shù)字會議為合作制定了計劃，此前他們猜測細(xì)菌中的Cas9最終執(zhí)行切割DNA的作用，但在體外并沒有得到驗證。

2012年，她們將重組表達的Cas9與體外轉(zhuǎn)錄的crRNA和tracrRNA聯(lián)合使用，成功構(gòu)建出可體外切割純化DNA的CRISPR/Cas系統(tǒng)：通過成熟的crRNA與tracrRNA形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)Cas9蛋白靶向結(jié)合目的DNA片段，通過切割引起DNA雙鏈斷裂，從而使得CRISPR/Cas系統(tǒng)具有編輯基因的可能[2]。

在沙彭蒂耶和杜德納的工作啟發(fā)下，美國哈佛大學(xué)丘奇（G. Church）研究組與張鋒研究組率先在哺乳動物中實現(xiàn)了基因編輯[3，4]。其后，在短短幾年內(nèi)這項技術(shù)風(fēng)靡世界各地的實驗室，成為生物學(xué)界最流行的基因編輯工具。

2013年，世界各地先后已經(jīng)有多家實驗室使用 CRISPR/Cas9，在包括人細(xì)胞系和多種模式生物中，比如斑馬魚、酵母、線蟲、果蠅、小鼠、大鼠等，實現(xiàn)了對目的基因的編輯[5]。2015年CRISPR技術(shù)被美國《科學(xué)》周刊評為年度最佳科學(xué)突破。

2016年，張鋒課題組率先將一種稱為C2c2（也稱Cas13a）的酶，用于CRISPR系統(tǒng)中，成功地對RNA進行了編輯。同年10月份，又有科學(xué)家首次利用CRISPR/Cas9編輯過的細(xì)胞開展人體臨床試驗，他們從患有轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者血液中分離出的免疫細(xì)胞，通過CRISPR/Cas9技術(shù)特異性地敲除其中的PD-1基因，然后經(jīng)體外擴增培養(yǎng)，再回輸入患者體內(nèi)，以期達到治愈癌癥的目標(biāo)。

2017年，美國邁阿密大學(xué)的課題組設(shè)計了CRISPR-RNA-靶向（CRISPR-RNA-targeting， CRISPR-RT）系統(tǒng)，對RNA編輯做出了很大貢獻。此外，除了Cas13a，Cas13b和Cas13d的發(fā)現(xiàn)也推動了CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用與發(fā)展。同年，劉如謙團隊將tRNA腺嘌呤脫氨酶的蛋白定向進化后，與CRISPR/ Cas9系統(tǒng)融合，在不引起DNA鏈斷裂的情況下實現(xiàn)了A-T到G-C的轉(zhuǎn)換，且其在人體細(xì)胞中的編輯效率超過50%。為治療多種單堿基突變遺傳疾病提供了有效工具[6]。

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯新工具層出不窮，2018年，劉如謙團隊又進化出一種能夠識別多種PAM序列的Cas9變體，提高了CRISPR/Cas9的剪輯效率。同年，杜德納發(fā)布了CRISPR/Cas14系統(tǒng)。2019年，杜德納成功地對Cas9蛋白的活性進行了改造，使之僅在特定組織中具有活性。張鋒也開發(fā)出CRISPR/Cas12b系統(tǒng)，極大豐富了用于基因組編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng)。

2020年初，新型冠狀病毒肺炎爆發(fā)，科學(xué)家基于CRISPR/Cas13a技術(shù)開發(fā)了用于檢測和定量SARSCoV-2病毒RNA的試劑盒，它無需對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，而是直接對病毒RNA進行檢測。正如沙彭蒂耶所說：“CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)突破了界限，使基因工程技術(shù)更加地通用、有效和易操作。它的應(yīng)用似乎真的沒有什么限制[7]?！?/p>

CRISPR的工作原理

在噬菌體或質(zhì)粒等外源DNA入侵宿主后，外來核酸被加工成短片段，并被作為新的間隔子整合到宿主染色體內(nèi)的CRISPR重復(fù)間隔子序列中，這個過程相當(dāng)于宿主的一次“免疫記憶”。在外源核酸上鄰近間隔子序列下游有一段極其保守的基序（PAM），它對于間隔子序列的選擇加工非常重要。當(dāng)入侵者再次入侵時，CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被核酸內(nèi)切酶加工為成熟crRNA。crRNA的5’端包含被整合進宿主基因組的間隔子序列，它可與外源序列互補配對，而3’端包含一段CRISPR的重復(fù)序列，與tracrRNA結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)。帶有Cas內(nèi)切酶的crRNA-tracrRNA組裝成核糖核蛋白復(fù)合體，通過間隔子序列與入侵核酸互補，進行特異性的破壞，從而實現(xiàn)宿主（細(xì)菌）的“二次免疫應(yīng)答”[8]。

根據(jù)CRISPR基因座的不同，CRISPR系統(tǒng)可分為6種類型（Ⅰ-Ⅵ），它們有著不同的crRNA模式和特定的Cas蛋白[9]。與利用復(fù)雜的多Cas蛋白復(fù)合物進行crRNA結(jié)合和靶序列降解的Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)不同，Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)采用單一核酸內(nèi)切酶Cas9來識別雙鏈DNA的靶位點，核酸內(nèi)切酶Cas9的兩個結(jié)構(gòu)域（HNH和RuvC）分別切割兩條DNA鏈。這兩個不同結(jié)構(gòu)域在PAM上游3個堿基對處剪接雙鏈DNA，HNH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crRNA互補的DNA鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割另一條DNA鏈。其間，tracrRNA與crRNA中的重復(fù)序列堿基互補配對，形成獨特的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)。這個雙鏈RNA分子中約20個堿基靶向與其序列互補的DNA序列，并由Cas9進行DNA位點特異性切割，產(chǎn)生平末端的雙鏈斷裂缺口。然后，通過機體自身的DNA修復(fù)機制進行修復(fù)。一種是極易出錯的非同源末端連接修復(fù)（nonhomologous end joining， NHEJ），在切割位點產(chǎn)生短的隨機插入和（或）缺失；一種是通過高保真的同源重組修復(fù)（homology directed repair， HDR），在同源修復(fù)模板指導(dǎo)下，對DSB位點進行精確的修復(fù)。后來，通過人為地將crRNA和tracrRNA進行組合，形成單條RNA進行轉(zhuǎn)錄表達，得到嵌合的單鏈向?qū)NA（singleguide RNA， sgRNA），就極大地簡化了CRISPR基因編輯方法。

CRISPR的優(yōu)勢

基因編輯技術(shù)從本質(zhì)上來講，是對DNA雙鏈斷裂損傷和修復(fù)機制的應(yīng)用。外在因素如輻射和內(nèi)在因素如細(xì)胞代謝產(chǎn)物，都會使DNA產(chǎn)生不同程度的損傷，DNA雙鏈斷裂是真核細(xì)胞中常見的一種DNA損傷類型，DNA雙鏈斷裂后，機體會通過兩種修復(fù)機制進行及時修復(fù)：非同源末端修復(fù)和同源重組修復(fù)[10]。截至目前，基因編輯技術(shù)已經(jīng)過三代更迭，從鋅指核酸酶（zinc finger nucleases， ZFNs）技術(shù)，轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶（transcription activator like effector nucleases， TALENs）技術(shù)，再到CRISPR/Cas技術(shù)[11]。

ZFNs是融合蛋白，由鋅指蛋白和細(xì)菌的FokⅠ限制酶組成。鋅指蛋白包括串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)域，它們屬于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。每個鋅指結(jié)構(gòu)域識別3個堿基，串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)域使得ZFNs可潛在地結(jié)合到長的核苷酸序列上。使用時需成對設(shè)計，一個切割位點在側(cè)翼的正義鏈，另一個切割位點在側(cè)翼的反義鏈。當(dāng)切割位點兩側(cè)的ZFNs結(jié)合后，F(xiàn)okⅠ限制酶在該位點發(fā)生二聚化并進行切割，造成具5’突出端的雙鏈斷裂。ZFNs技術(shù)使得DSB不必依賴自然發(fā)生，從而為基因工程發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

TALENs的構(gòu)造與ZFNs類似，由串聯(lián)的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子（TALE）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和FokI限制酶組成。與ZFNs不同的是，每個TALE蛋白識別單個特異性核苷酸，因此其結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，但設(shè)計更簡單。然而，ZFNs和TALENs技術(shù)操作難度大、構(gòu)建組裝時間長，容易在細(xì)胞中積累，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，動物實驗已證明它們會引發(fā)機體的免疫反應(yīng)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)由向?qū)NA和Cas核酸酶組成，向?qū)NA結(jié)合到目的基因上，引導(dǎo)Cas蛋白切割目的序列產(chǎn)生雙鏈斷裂，根據(jù)不同實驗?zāi)康倪x擇不同Cas蛋白。通過修飾向?qū)NA的序列，就可以切割所選的任何靶序列。類似于ZFNs和TALENs系統(tǒng)，CRISPR/ Cas系統(tǒng)可用于通過非同源末端連接修復(fù)方式，在DNA切割位點處引入隨機突變，也可通過共同注射與DNA同源的工程化DNA載體，通過同源重組修復(fù)方式引入特定突變或插入。CRISPR/Cas系統(tǒng)使基因定點修飾變得更加高效。

與ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)有很多優(yōu)勢：①設(shè)計簡單。CRISPR-Cas系統(tǒng)不像ZFNs和TALENs是依賴于蛋白與靶DNA之間的識別，而是由向?qū)NA和靶DNA之間形成核糖核苷酸復(fù)合物，利用核糖核苷酸識別靶向基因。②效率高，成本低。如創(chuàng)建突變小鼠時，僅需要將編碼Cas蛋白和向?qū)NA的RNA直接注射到小鼠胚胎中，相較轉(zhuǎn)染和選擇小鼠胚胎干細(xì)胞注射小鼠、再進行同源重組的方法，可節(jié)省幾個月甚至幾年時間。③可同時進行多基因突變操作。Cas9蛋白單體可與任意數(shù)量不同序列的特異性向?qū)NA組合，輕松實現(xiàn)用CRISPR/Cas9文庫進行多重基因組編輯。

CRISPR的應(yīng)用與展望

在短短不到10年時間里，CRISPR得到了前所未有的高速發(fā)展，基于CRISPR的各類技術(shù)已在科研、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等諸多方面得到廣泛應(yīng)用。研究人員可以精確編輯引發(fā)疾病的突變基因，以使從根源上治愈此前束手無策的疾病。比如，通過特殊的病毒將CRISPR系統(tǒng)遞送到特定細(xì)胞中，針對性地修復(fù)致病的突變基因，目前這已在鐮刀型貧血癥、杜氏肌萎縮癥等疾病中成功驗證，并尋求臨床實驗[12]。在農(nóng)業(yè)基因育種上，CRISPR技術(shù)可以對農(nóng)作物基因組進行更便捷而又精確的修飾，以獲得更好的遺傳性狀，比如增強農(nóng)作物抗性、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、提高產(chǎn)量。

CRISPR盡管其在基因編輯上展示出了巨大的潛力，但也存在不可忽視的風(fēng)險。自CRISPR技術(shù)問世以來，關(guān)于其造成脫靶（即可能切割非目的序列的風(fēng)險）的討論就從未停止過，盡管也在不斷地進行優(yōu)化，降低脫靶率，但至今尚未從根本上解決問題，錯誤地修飾其他基因可能會造成一系列無法想象的嚴(yán)重后果，這是CRISPR應(yīng)用所面臨的一大障礙。

基因編輯導(dǎo)致的倫理問題，除了在醫(yī)療方面有待進一步討論和解決外，還有對于基因改造的倫理問題，比如用于強化人的某些生理機能，甚至造出一個“定制人”，都是需要我們認(rèn)真思考和對待的。現(xiàn)今在人類胚胎上的應(yīng)用應(yīng)當(dāng)受到嚴(yán)格管控，在關(guān)注其帶來的增益效果時，其帶來的風(fēng)險一樣應(yīng)是每個人必須深思熟慮。

管控風(fēng)險、避免違反倫理道德，并將其合理應(yīng)用到生活中，是人類共同的責(zé)任。我們要在風(fēng)險和倫理問題上時刻保持警惕和謹(jǐn)慎，也期待CRISPR在將來為人類帶來更多的意想不到的驚喜。

[1]Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product. J Bacteriol， 1987， 169（12）： 5429-5433.

[2]Jinek M， Chylinski K， Fonfara I， et al. A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science， 2012， 337（6096）： 816-821.

[3]Mali P， Yang L， Esvelt K M， Et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science， 2013， 339（6121）： 823-826.

[4]Cong L， Ran F A， Cox D， et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science， 2013， 339（6121）： 819-823.

[5]Hsu P D， Lander E S， Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell， 2014， 157（6）： 1262-1278.

[6]Lander Eric S. The heroes of CRISPR. Cell， 2016， 164（1）： 18-28.

[7]Doudna J， Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science （New York， NY）， 2014， 346， 1258096.

[8]Barrangou R， Marraffini L A. CRISPR-Cas systems： prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Mol Cell， 2014， 54（2）： 234-44.

[9]Makarova K S， Wolf Y I， Alkhnbashi O S， et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol， 2015， 13（11）： 722-736.

[10]Ensminger M， L？brich M. One end to rule them all： nonhomologous end-joining and homologous recombination at DNA double-strand breaks. Br J Radiol， 2020， 93（1115）： 20191054.

[11]Gaj T， Gersbach C A， Barbas C F. ZFN， TALEN， and CRISPR/ Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol， 2013， 31（7）： 397-405.

[12]Xu Y Y， Li Z J. CRISPR-Cas systems： overview， innovations and applications in human disease research and gene therapy. Comput Struct Biotechnol J， 2020， 18： 2401-2415.

關(guān)鍵詞：諾貝爾化學(xué)獎 基因編輯 CRISPR 修復(fù) ■