沈 麗 陶艷艷 趙志敏，2 劉洪亮 劉成海，2，3△

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所（上海，201203）2.上海市中醫(yī)臨床重點實驗室 3.上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院

甘草是豆科甘草屬多年生草本植物甘草的根及根莖［1］，甘草性平，味甘，有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、止咳祛痰、緩急定痛、調(diào)和諸藥等功效［2］，其有效成分具有保肝作用。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（SEC）是構(gòu)成肝竇的主要細(xì)胞，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞因缺血、缺氧受損時，可出現(xiàn)腫脹甚至破壞，使肝竇變窄、肝細(xì)胞血流供應(yīng)減少，從而誘發(fā)或加重肝細(xì)胞損傷。缺血和缺氧常常是相互伴隨的，各種研究表明顯示，二氯化鈷（CoCl2）是已經(jīng)被廣泛應(yīng)用的模擬缺氧環(huán)境的化學(xué)試劑，能夠產(chǎn)生與缺血、缺氧相似的反應(yīng)［3］。SK-HEP-1 細(xì)胞株［4］是無限增殖的人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞株，具備肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的兩大關(guān)鍵特點：一是窗孔結(jié)構(gòu)，二是細(xì)胞內(nèi)吞作用（SEC關(guān)鍵功能特點），因而，SK-HEP-1 細(xì)胞是我們進(jìn)行中藥體外活性物質(zhì)篩選的理想肝竇內(nèi)皮細(xì)胞載體。本研究采用CoCl2誘導(dǎo)SK-HEP-1 細(xì)胞株缺氧模型，篩選抗肝竇內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的甘草活性成分。

1 材料與方法

1.1 藥物 甘草酸單銨鹽、甘草酸二銨鹽、異甘草素、甘草次酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷，由上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司分離、提取、鑒定，純度＞98%。

1.3 試劑 六水合氯化鈷（CoCl2·6H2O，Cat#080M0101V），購自Sigma 公司。Dimethyl sulfoxide（DMSO，Cat#0231），購自Amresco 公司。MEM 培養(yǎng)基（Minimum Eagle’s Medium，Cat#41500-067）、胎牛血清（FBS，Cat#10099）購自美國Gibco公司。CCK8（cell counting kit-8，Cat#C0038）、DAPI 細(xì)胞核染色液（2-（4-Amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride，Cat#C0038）、DAF-FMDA（NO 熒光探針，Cat#S0019）、一氧化氮合酶（NOS，Cat#S0025）、活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，Cat# S0033），購自碧云天生物技術(shù)研究所；EdU 細(xì)胞增殖試劑盒（Cell-LightTMEdU DNA Cell Proliferation Kit，Cat#C10310），購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) SK-HEP-1 細(xì)胞，以10%FBS/MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3～4 天傳代1次。

1.4.2 藥物配制 ①CoCl2·6H2O，無菌超純水溶解，貯存液濃度為 2mol/L。②甘草各單體成分溶解于二甲基亞砜（DMSO），貯存濃度為100 mmol/L。

1.4.3 氯化鈷缺氧損傷模型 SK-HEP-1 細(xì)胞懸液以7×107/L按照每孔100 l 接種于96 孔板，待細(xì)胞培養(yǎng)融合成亞單層，棄培養(yǎng)液。CoCl2以10%FBS/MEM稀釋，工作濃度為12.5～1600 mol/L 添加至SK-HEP-1 細(xì)胞，同時設(shè)10% FBS/MEM 培養(yǎng)液作為對照，分別孵育6h、12h、24h、48h、72h。棄CoCl2孵育液，添加CCK8 工作液，100 l/孔，再孵育2h，A450 測各孔吸光度。

1.4.4 藥物添加 SK-HEP-1 細(xì)胞長至亞單層，分空白對照組（Normal）、CoCl2800 mol/L 組（Model）、甘草各單體成分（2～3個濃度）組、同時設(shè)相同濃度DMSO作為對照，培養(yǎng)箱孵育24h，觀察不同濃度甘草單體對CoCl2誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的防護(hù)作用。

1.4.5 EdU 摻入法 參考文獻(xiàn)［5］步驟，Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader 采集圖像，Cellomics Cell Health Profiling Bio-Application Software 對圖像進(jìn)行分析。

1.4.6 細(xì)胞免疫熒光染色DAF-FM DA（NO熒光探針）、活性氧（ROS）檢測與一氧化碳合成酶（NOS）檢測，分別參考文獻(xiàn)［6，7］按試劑盒說明書方法，Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader 采集圖像，Cellomics Cell Health Profiling BioApplication Software對圖像進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用表示，符合正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)用單因素方差分析，不符合正態(tài)性或方差齊性的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CoCl2誘導(dǎo)SK-HEP-1 細(xì)胞缺氧損傷模型建立 分別以含12.5～1600 mol/L CoCl2的培養(yǎng)液孵育SK-HEP-1 細(xì)胞6～72h，CCK8 檢測細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，800 mol/L CoCl2作用24h，對SKHEP-1 細(xì)胞活力抑制率達(dá)到50%（見圖1A）。進(jìn)一步檢測SKHEP-1 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，800 mol/L CoCl2作用24h后SK-HEP-1細(xì)胞內(nèi)活性氧水平最高（見圖1B）。CCK8 法與細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測結(jié)果提示，800 mol/L CoCl2作用24h 能成功誘導(dǎo)SK-HEP-1 細(xì)胞缺氧損傷模型。

圖1 A CoCl2對SK-HEP-1 細(xì)胞活力的影響

圖1 B CoCl2誘導(dǎo)SK-HEP-1 細(xì)胞活性氧熒光強(qiáng)度半定量分析（與Normal 相比，## P<0.05）

2.2 甘草成分對SK-HEP-1 細(xì)胞活力的影響 見表1。

表1 甘草各成分對SK-HEP-1 細(xì)胞活力的影響

基于前期甘草各單體對SK-HEP-1 細(xì)胞毒性實驗結(jié)果，分別選擇異甘草素（0.625、1.25、2.5 mol/L）、甘草苷（20、40、80 mol/L）、甘草素（20、40、80 mol/L）、甘草酸二銨鹽（20、40、80 mol/L）、甘草酸單銨鹽（20、40、80 mol/L）、異甘草苷（20、40、80 mol/L）、甘草次酸（1.25、2.5 mol/L）與CoCl2誘導(dǎo)過氧化損傷的SK-HEP-1 細(xì)胞孵育24h，CCK8 檢測結(jié)果提示（見表1），異甘草素、甘草酸二銨鹽能顯著改善CoCl2誘導(dǎo)缺氧損傷SKHEP-1 細(xì)胞活力抑制作用；甘草苷、甘草素、甘草酸單銨鹽與異甘草苷對CoCl2誘導(dǎo)缺氧損傷SK-HEP-1 細(xì)胞活力抑制無明顯改善；甘草次酸對CoCl2誘導(dǎo)缺氧損傷SK-HEP-1 細(xì)胞活力有明顯抑制作用。進(jìn)一步檢測SK-HEP-1 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，800 mol/L CoCl2作用24h后SK-HEP-1細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯升高，不同濃度異甘草素、甘草酸二銨鹽明顯降低CoCl2誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平（見圖2 及插頁圖3）。上述結(jié)果提示，甘草中7個單體成分（異甘草素、甘草苷、甘草素、甘草酸二銨鹽、甘草酸單銨鹽、異甘草苷、甘草次酸、）中，異甘草素與甘草酸二銨鹽對CoCl2誘導(dǎo)SK-HEP-1 細(xì)胞缺氧損傷有明顯防護(hù)作用。

2.3 異甘草素與甘草酸二銨鹽對SK-HEP-1 細(xì)胞增殖的影響（見插頁圖4）。EdU法檢測結(jié)果提示，與空白對照組相比，800 mol/L CoCl2顯著抑制SK-HEP-1 細(xì)胞增殖，0.625 M、1.25 M、2.5 M異甘草素以及20 M、40 M、80 M甘草酸二銨鹽可拮抗CoCl2引起的SK-HEP-1 細(xì)胞增殖降低。

圖2 異甘草素與甘草酸二銨鹽對CoCl2誘導(dǎo)SK-HEP-1 細(xì)胞內(nèi)活性氧表達(dá)的影響（熒光強(qiáng)度半定量分析，與Normal 相比，## P<0.05；與Model比較，** P<0.05）

2.4 異甘草素與甘草酸二銨鹽對SK-HEP-1 細(xì)胞內(nèi)一氧化氮（NO）含量的影響 見圖5。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，CoCl2誘導(dǎo)過氧化損傷SK-HEP-1 細(xì)胞NO 含量降低，0.625 M、1.25 M、2.5 M 異甘草素以及20 M、40 M、80 M 甘草酸二銨鹽對CoCl2誘導(dǎo)的過氧化損傷SK-HEP-1 細(xì)胞內(nèi)NO含量明顯增加。

圖5 異甘草素與甘草酸二銨鹽對SK-HEP-1 細(xì)胞內(nèi)（NO）含量的影響(與Normal 相比，## P<0.01；與Model 相比，** P<0.05)

2.5 異甘草素與甘草酸二銨鹽對SK-HEP-1 細(xì)胞NOS活性的影響 見圖6。

圖6 異甘草素與甘草酸二銨鹽對SK-HEP-1 細(xì)胞NOS 活性的影響(與Normal 相比，## P<0.01；與Model 相比，** P<0.05)

實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，CoCl2誘導(dǎo)過氧化損傷SK-HEP-1 細(xì)胞NOS 活性降低，0.625 M、1.25 M、2.5 M 異甘草素以及20 M、40 M、80 M甘草酸二銨鹽明顯升高CoCl2誘導(dǎo)的過氧化損傷SK-HEP-1 細(xì)胞內(nèi)NOS 活性。

3 討論

CoCl2是一種化學(xué)性低氧模擬劑，在不同的細(xì)胞能模擬低氧/缺氧性損傷，表現(xiàn)為促進(jìn)活性氧（ROS）生成，降低線粒體膜電位，并引起細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡。CoCl2模擬缺氧是國際上比較常用的模擬缺氧方法，鈷離子能競爭氧感受器-血紅蛋白卟啉環(huán)中的鐵離子，抑制氧合血紅蛋白的形成而喪失與氧結(jié)合的能力，誘發(fā)一系列類似缺氧反應(yīng)，從而模擬缺氧狀態(tài)［6］。SEC是構(gòu)成肝竇壁的主要細(xì)胞，幾乎參與肝臟所有的生理、病理過程，SEC 在肝臟損傷過程中的作用主要表現(xiàn)在兩個方面：一方面，SEC 本身受到損害，并因此加重肝臟損傷程度；另一方面，SEC 又可激活并釋放出某些細(xì)胞因子去調(diào)節(jié)或損傷肝細(xì)胞。

本研究以人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞株SK-HEP-1為對象，建立CoCl2誘導(dǎo)的缺氧模型。結(jié)果顯示，經(jīng)CoCl2處理的SK-HEP-1 細(xì)胞存活率明顯下降，800 mol/L CoCl2作用24 小時，對SK-HEP-1細(xì)胞活力抑制率達(dá)到50%；進(jìn)一步檢測SK-HEP-1 細(xì)胞內(nèi)ROS水平發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，隨著CoCl2濃度增加、作用時間延長，細(xì)胞存活率明顯下降、細(xì)胞內(nèi)ROS 含量表達(dá)隨CoCl2刺激劑量的增加而增加，800 mol/L CoCl2作用24h 后SK-HEP-1細(xì)胞內(nèi)ROS 水平最高，說明800 mol/L CoCl2作用24h 成功建立了CoCl2模擬缺氧模型。

一氧化氮合酶（NOS）是合成一氧化氮（NO）的關(guān)鍵酶，NOS 家族主要通過催化L-精氨酸與氧分子結(jié)合生成NO。目前，已有大量的證據(jù)表明NO在多種原因引起的肝損傷和肝纖維化中起重要作用［7，8］。本研究用氯化鈷模擬SK-HEP-1 細(xì)胞缺氧，采用藥物高內(nèi)涵篩選分析（HCS）［9，10］測定細(xì)胞內(nèi)NOS、NO等水平以此評估細(xì)胞缺氧程度，結(jié)果提示，800 mol/L CoCl2作用24h 誘導(dǎo)SK-HEP-1 細(xì)胞過氧化損傷模型中細(xì)胞內(nèi)NOS活性與NO含量升高。本研究選擇甘草成分異甘草素、甘草苷、甘草素、甘草酸二銨鹽、甘草酸單銨鹽、異甘草苷、甘草次酸，進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異甘草素與甘草酸二銨鹽對CoCl2誘導(dǎo)SKHEP-1 細(xì)胞活力抑制有明顯改善作用；同時發(fā)現(xiàn)，異甘草素與甘草酸二銨鹽明顯促進(jìn)對CoCl2誘導(dǎo)SK-HEP-1 過氧化損傷細(xì)胞增殖；細(xì)胞免疫熒光染色提示，異甘草素與甘草酸二銨鹽可顯著改善CoCl2誘導(dǎo)的SK-HEP-1 細(xì)胞NO 含量及NOS 活性，抑制ROS 含量，具有一定的劑量依賴性。

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞作為肝中一種具有諸多功能的間質(zhì)細(xì)胞，在急、慢性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用。本研究篩選出甘草單體成分異甘草素與甘草酸二銨鹽對CoCl2誘導(dǎo)的SK-HEP-1 細(xì)胞缺氧損傷有顯著防護(hù)作用，同時顯著改善CoCl2誘導(dǎo)的SK-HEP-1 細(xì)胞NO 含量及NOS 活性，抑制ROS含量，但其具體作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

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