湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科（湖北 武漢，430074）

自1989年Carman［1］首次發(fā)現(xiàn)HBV前C 區(qū)1896 位點(diǎn)的變異可形成HBeAg（－）的CHB之后，Okamoto等［2］研究發(fā)現(xiàn)BCP區(qū)變異也可形成HBeAg（－）CHB。國(guó)內(nèi)外對(duì)PreC 區(qū)/BCP 區(qū)變異的分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)改變及對(duì)疾病的影響等方面進(jìn)行了一系列研究［3，4］。近年來(lái)，HBV PreC 區(qū)/BCP 區(qū)變異研究也出現(xiàn)新的進(jìn)展［5］，為了解慢性HBV 感染者HBV PreC 區(qū)變異與HBV復(fù)制關(guān)系，我們對(duì)慢性HBV感染者進(jìn)行研究，探討其HBV PreC區(qū)/BCP 區(qū)基因突變與其病程進(jìn)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 我院2010年10月至2013年6月住院患者。其中AsC組63例（男42例，年齡28～68歲；女21例，年齡24～65歲）；CHB 組82例（男68例，年齡32～71歲；女14例，年齡25～68歲）；CHB-LC組20例（男15例，年齡45～76歲；女5例，年齡46～67歲）。所有病例診斷均符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，此前受試者均未核苷類藥物、干擾素抗病毒和免疫調(diào)節(jié)治療，排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染及酒精、藥物和自身免疫性肝病。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)項(xiàng)目及試劑 ①血生化檢測(cè)：各觀察組患者均檢測(cè)血清AST、ALT、TP、Alb、A/G 比值、AFP 和TBA（總膽汁酸）。由寧波美康科技有限公司提供相應(yīng)試劑盒。儀器為美國(guó)產(chǎn)雅培C-8000 全自動(dòng)生化分析儀。②外周血清HBV DNA 含量的測(cè)定：收集患者血清，－70℃凍存至檢。采用熒光定量PCR 法（FQ-PCR）檢測(cè)患者血清HBV DNA含量，使用上海宏石全自動(dòng)基因擴(kuò)增儀，試劑盒由武漢百泰基因有限公司生產(chǎn)，試劑盒的最低檢出限度為500 IU/ml，線性范圍5.0×102～1.0×108IU/ml。③HBeAg 檢測(cè)：用于評(píng)價(jià)HBV PreC 區(qū)/BCP 區(qū)基因突變?cè)谂R床上的應(yīng)用價(jià)值。HBeAg 檢測(cè)試劑盒由北京萬(wàn)泰藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。④HBV PreC 區(qū)/BCP 區(qū)基因突變：采用FQ-PCR 法檢測(cè)患者血清HBV PreC 區(qū)1896 位點(diǎn)突變和BCP 區(qū)1762／1764 雙位點(diǎn)突變。試劑為武漢百泰基因有限公司生產(chǎn)。儀器為上海宏基因擴(kuò)增儀。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組患者血生化檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與AsC組比較：CHB 組、CHB-LC 組患者血清ALT、AST、AFP、TBA 水平升高，差異有顯著性意義（P<0.01），呈顯著正相關(guān)；而TP、Alb、A/G 水平降低，差異有顯著性意義（P<0.05），呈負(fù)相關(guān)。

表1 3組患者血生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較（）

表1 3組患者血生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較（）

與AsC 組比較，▲ P<0.05，▲▲P<0.01

2.2 3 組患者外周血清HBVDNA 含量和HBeAg 定性檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。由表2 可看出，HBeAg（－）可出現(xiàn)在慢性HBV 感染的不同病程，HBeAg（－）患者存在病毒復(fù)制。

表2 3 組患者HBV DNA 和HBeAg 檢測(cè)結(jié)果

2.3 HBV PreC 區(qū)/BCP 區(qū)基因突變檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 HBeAg（+）組與HBeAg（－）組BCP 區(qū)與PreC 區(qū)突變分析 見(jiàn)表3。

表3 HBeAg（+）組HBeAg（－）組中BCP 區(qū)1762+1764 和PreC 區(qū)1896 突變分布［n(%)］

由表3 可見(jiàn)，HBeAg（+）組樣本中，BCP區(qū)的突變率均高于PreC區(qū)突變率，差異有顯著性意義（2=11.14，P<0.001）；HBeAg（－）組樣本中，BCP 區(qū)的突變率均高于PreC 區(qū)突變率，差異有顯著性意義（2=37.8，P<0.001）。

2.3.2 慢性HBV 感染不同臨床類型患者PreC 區(qū)/BCP 區(qū)變異的結(jié)果 見(jiàn)表4。

表4 HBV Pre C 區(qū)/BCP 區(qū)變異與不同臨床類型感染者的關(guān)系［n(%)］

由表4 可見(jiàn)，AsC 組、CHB 組、CHB-LD 組PreC 區(qū)1896、BCP 區(qū)1762/1764 變異率依次升高。與AsC 組比較：CHB 組PreC 區(qū)l896、BCP 區(qū)1762/1764 變異率升高，差異有顯著性意義，P<0.05；而CHB-LC 組差異有非常顯著性意義，P<0.01。

3 討論

HBV 屬嗜肝DNA病毒，其基因組長(zhǎng)約3.2 kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。HBV基因組主要包括4個(gè)開(kāi)放讀碼框（ORF）分別位于S 區(qū)、C 區(qū)、P 區(qū)、X 區(qū)。PreC 區(qū)及C區(qū)位于同一個(gè)ORF 內(nèi)，它們編碼兩種轉(zhuǎn)錄：前基因組RNA（pgRNA）和前C 區(qū)mRNA。HBV Pre C 區(qū)編碼前C 信號(hào)肽，引導(dǎo)HBeAg 前體至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過(guò)細(xì)胞分泌器加工處理后形成成熟的HBeAg 從肝細(xì)胞分泌出去；1862 位點(diǎn)G—T 的置換導(dǎo)致病毒前核心蛋白氨基酸密碼子的改變，變?yōu)榻K止密碼子，從而阻斷了HBeAg 的產(chǎn)生［6］。BCP是HBV復(fù)制的關(guān)鍵性調(diào)控因子，調(diào)控HBV 前C 基因組mRNA和前基因組mRNA轉(zhuǎn)錄；BCP 區(qū)的雙突變（1762，1764）可使3’端莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，穩(wěn)定性增強(qiáng)，促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)錄的發(fā)生和復(fù)制［7］，因此BCP 區(qū)的變異被視為影響病毒復(fù)制、HBeAg 表達(dá)的主要因素之一［8］。同時(shí)BCP 中的雙突變可能與活動(dòng)性肝炎、肝硬化（LC）、原發(fā)性肝癌（HCC）相關(guān)［9］。

慢性HBV感染者病情輕重是由宿主和病毒兩方面所決定，許多研究都顯示C 基因變異與肝炎活動(dòng)及嚴(yán)重性有關(guān)［10］。目前認(rèn)為，有PreC 區(qū)變異的抗-HBe 陽(yáng)性進(jìn)展性肝炎（atypical type），這類患者HBeAg（－），HBVDNA（+），多有PreC區(qū)終止碼變異。當(dāng)HBV PreC 區(qū)1896 G→A 變異后，使末端產(chǎn)生翻譯終止密碼子TAG，導(dǎo)致HBeAg 前體蛋白的合成中斷，造成HBeAg 減少或消失，但病毒本身復(fù)制不受影響。BCP 區(qū)的1762 位A→T 與1764 位G→A 雙變異可能引起嚴(yán)重慢性肝臟疾?。?1］。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者在研究HBV Pre C 區(qū)/BCP 區(qū)基因突變多采用患者血清HBV DNA 提取、純化、測(cè)序、巢式PCR 擴(kuò)增、限制性基因多態(tài)性片段確定基因位點(diǎn)突變，由于操作繁瑣，難于在臨床上推廣應(yīng)用。我們采用武漢百泰基因有限公司生產(chǎn)的HBV Pre C 區(qū)1896 位點(diǎn)基因突變、BCP 區(qū)1762/1764 位點(diǎn)基因突變?cè)噭┖?，?jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確應(yīng)用于臨床。我們對(duì)慢性HBV 感染者中AsC 63例、CHB 82例、CHB-LC 20例進(jìn)行分析，血清生化指標(biāo)在慢性HBV 感染者病程進(jìn)展中呈現(xiàn)相關(guān)性。其中ALT、AST、AFP、TBA水平升高，差異有顯著性意義（P<0.01），呈顯著正相關(guān)；而TP、Alb、A/G水平降低，差異有顯著性意義（P<0.05），呈負(fù)相關(guān)。與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相符。

AsC 組、CHB 組、CHB-LC 組HBV DNA 含量以及HBeAg檢測(cè)結(jié)果及HBeAg（+）組樣本中，BCP區(qū)的突變率均高于PreC區(qū)突變率，差異有顯著性意義（P<0.05）；HBeAg（－）組樣本中，BCP 區(qū)的突變率均高于PreC 區(qū)突變率，差異有非常顯著性意義（P<0.01）。提示HBeAg（－）慢性HBV 感染患者需要謹(jǐn)防HBV 復(fù)制的危險(xiǎn)性。

PreC 區(qū)、BCP 區(qū)變異在AsC 組、CHB 組、CHB-LC 組發(fā)生率依次增高，不僅提示PreC區(qū)、BCP區(qū)變異可以預(yù)測(cè)慢性HBV感染者病情的發(fā)生發(fā)展程度，還可能出現(xiàn)肝臟惡變的可能性［12］。

隨著對(duì)HBV 基因型研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其基因型與基因變異之間似乎存在一定的相關(guān)性。例如A、F 基因型的HBV不易發(fā)生Pre C 區(qū)1896 突變，而其他基因型該位點(diǎn)的突變率較高。一些學(xué)者研究認(rèn)為B 基因型HBV 的Pre C 區(qū)1896 位點(diǎn)較C 基因型更容易發(fā)生G→A 的突變，C 基因型感染者BCP 區(qū)雙突變率較B 基因型感染者高。即BCP 區(qū)突變率高與C 基因型分布多有關(guān)［13］。盡管近年來(lái)對(duì)HBV PreC 區(qū)、BCP 區(qū)基因變異的研究已經(jīng)較為廣泛和深入，但HBV S 區(qū)、C 區(qū)、P 區(qū)、X 區(qū)也會(huì)出現(xiàn)基因突變，會(huì)影響慢性HBV感染者人群病程的變化；不同種族對(duì)基因突變的易感性也不同；患者自身免疫力，生存環(huán)境也會(huì)影響此類患者的病程。要對(duì)我國(guó)慢性HBV 感染人群監(jiān)控，值得全社會(huì)去共同關(guān)心［14］。

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