單琳琳，陳傳稀，蔡夢(mèng)思，黃利鋒，何 瑩，高建芳

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310036）

蝮亞科毒蛇是中國(guó)分布廣、資源保有量較多的類群，經(jīng)常會(huì)有人被蝮蛇咬傷，這些種類涉及亞洲蝮屬、竹葉青蛇屬、原矛頭蝮屬和烙鐵頭屬等廣義蝮蛇.每當(dāng)水患過后，各類蝮蛇所致蛇傷病例會(huì)明顯增加，以致各地抗蛇毒血清儲(chǔ)備告急，進(jìn)而延誤了部分患者治療，如2010—2012年的長(zhǎng)江中下游省份水患就造成了重大影響.就全國(guó)蝮蛇類致傷病例而言，主要由竹葉青（Trimeresurusstejnegeri）、中介蝮（Gloydiusintermedius）、高原蝮（Gloydiusstrauchii）、短尾蝮（Gloydiusbrevicaudus）、烏蘇里蝮（Gloydiusussuriensis）、巖棲蝮（Gloydiussaxatilis）、菜花原矛頭蝮（Protobothropsjerdonii）和原矛頭蝮（Protobothropsmucrosquamatus）等種類所致，其中后5種所致蛇傷的影響范圍較廣，基本覆蓋除西北部省份以外的中國(guó)其它省份.

當(dāng)前國(guó)內(nèi)臨床使用的抗蝮蛇毒血清是以短尾蝮蛇毒為抗原免疫馬匹所制備的［1-2］，此類抗體的單價(jià)較貴，蛇傷治療成本相對(duì)較高.據(jù)覃公平抽樣調(diào)查的結(jié)果，國(guó)內(nèi)每年預(yù)計(jì)有近5萬人次需要注射抗血清［3］.然而，目前臨床上使用的抗蛇毒馬血清存在許多不足：制備周期長(zhǎng)、抗體純化的要求高、流通不方便、價(jià)格昂貴、可能帶來副作用等，使其生產(chǎn)與需求之間的矛盾一直不可緩解，從而影響了抗蛇毒血清在臨床上的廣泛應(yīng)用［4-5］.因此，在不斷完善和總結(jié)抗蛇毒血清制備技術(shù)的同時(shí)，新的蛇傷治療藥物的開發(fā)和研究有著極其重要的意義.

目前，在醫(yī)用抗體領(lǐng)域，雞源性抗體制備技術(shù)因其較傳統(tǒng)抗體制備技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用，如母雞飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、雞卵收集方便，無需抽取血液、無損傷，產(chǎn)率高、成本低、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、過敏性小等［6-11］.本研究選用萊航雞為載體，用蛇毒類毒素免疫并收集雞卵，旨在研究一種新型雞源性多價(jià)抗蝮蛇毒卵黃抗體，以求對(duì)上述廣義蝮蛇中的5種（短尾蝮、烏蘇里蝮、巖棲蝮、菜花原矛頭蝮和原矛頭蝮）蛇毒均有解毒效果，從而彌補(bǔ)單價(jià)馬源性抗蛇毒血清的不足，為蛇傷患者提供新的治療藥物.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用蛇毒及動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用短尾蝮、烏蘇里蝮、巖棲蝮、原矛頭蝮和菜花原矛頭蝮蛇毒為實(shí)驗(yàn)室自儲(chǔ)品.實(shí)驗(yàn)用萊航母雞（20～22周齡）2只購自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，母雞運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后用發(fā)酵床法單籠飼養(yǎng)于25 ℃恒溫室，控制室內(nèi)相對(duì)濕度為60%，光照時(shí)間16h，飼養(yǎng)期間提供足量的飲水和食物，在食物中添加適量鈣質(zhì)和維生素.每天檢查萊航母雞是否具有雞冠鮮紅、羽毛整齊光亮、兩眼明亮、精神活潑、當(dāng)人靠近時(shí)表現(xiàn)比較興奮、有求食欲以及能對(duì)外界刺激迅速作出反應(yīng)等特點(diǎn)，以便隨時(shí)判斷實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物的生理狀態(tài).

1.2 抗原制備及母雞免疫

動(dòng)物免疫主要參照劉四紅等［12］和王桂平等［13］的方法，并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整.將實(shí)驗(yàn)用5種蛇毒從-80 ℃超低溫冰箱取出后，恢復(fù)至室溫，隨后稱取實(shí)驗(yàn)所需劑量，溶于生理鹽水，控制溶液最終質(zhì)量濃度為10 mg／mL.各種蛇毒溶液等體積混合后，置于60 ℃恒溫水浴中孵育30min減毒制備類毒素.隨后離心取上清，并保存于-20 ℃冰箱備用.待萊航雞適應(yīng)環(huán)境后，將上述類毒素與弗氏完全佐劑（Sigma-Aldrich）混合乳化，以0.2mg／只的劑量經(jīng)雞雙翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位點(diǎn)注射進(jìn)行初次免疫.在初次免疫后第11、21和31天進(jìn)行首程、第二次和第三次加強(qiáng)免疫，注射用類毒素改由弗氏不完全佐劑（Sigma-Aldrich）乳化，3次免疫劑量分別為0.4、0.8和0.8mg／只.初次免疫前5天開始收集雞卵，直至免疫后90天結(jié)束，所有雞卵經(jīng)編號(hào)并判別是否正常后保存于4 ℃冰箱備用.

1.3 卵黃IgY抽提與濃度測(cè)定

合并單只雞每5d內(nèi)的全部雞卵，用水洗凈，并經(jīng)75%酒精消毒后，敲開蛋殼，用卵黃分離器盡量去除蛋白，之后將卵黃轉(zhuǎn)至濾紙上輕輕滾動(dòng)，盡量吸干殘余蛋清，用針刺破卵膜，收集卵黃液.通過凍融法、水稀釋法和PEG 法抽提IgY，用硫酸銨法獲得IgY 沉淀；隨后，將IgY 沉淀溶于0.01mol／L pH 7.4PBS后，用0.01mol／L pH 7.4的PBS緩沖液透析8h脫鹽，每隔2h更換緩沖液，收集脫鹽后溶液并冷凍干燥，保存于-20℃冰箱備用［14-17］.濃度測(cè)定時(shí)，取適量?jī)龈煞廴苡跓o菌水配制成抗體原液，用Bradford法測(cè)定卵黃抗體稀釋液濃度［18］，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次.

1.4 ELISA 檢測(cè)

卵黃抗體IgY 與蛇毒ELISA 檢測(cè)方法參照Gao等［19］.將質(zhì)量濃度為2μg／mL的5種蛇毒分別包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，用不含蛇毒的包被液作為對(duì)照，4 ℃包被過夜，每一反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)檢測(cè)孔.用PBST 漂洗液洗去未結(jié)合蛇毒，隨后各孔用2%脫脂奶粉在37 ℃封閉1h.PBST 漂洗液洗滌后，每孔加入每種抽提法所得的各個(gè)批次的IgY 溶液，37 ℃溫育1h.洗去未結(jié)合IgY 后，各孔加入經(jīng)PBST 溶液稀釋的驢抗雞IgY／IgG 二抗（上海生工，稀釋比1∶10 000），37℃溫育1h.用PBST 漂洗液洗去未結(jié)合的酶標(biāo)二抗后，各孔加入100μL底物液（含0.5mg／mL OPD 和0.006% H2O2的0.15mol／L檸檬酸鹽緩沖液，pH 5.0），反應(yīng)20min后加入50μL 2.5mol／L的硫酸終止顯色.隨后，用SpectraMax 384酶標(biāo)儀在490 nm 下讀取并記錄各孔的吸光值.計(jì)算所有OD 值的平均值及SD值，隨后用Sigmaplot 11.0軟件制作5種蛇毒與IgY 抗體免疫中和反應(yīng)的變化過程，并用Log Normal四參曲線公式擬合相應(yīng)的變化趨勢(shì).

1.5 SDS-PAGE和western blot檢測(cè)

蛇毒蛋白SDS-PAGE以及與卵黃抗體IgY 間的western blot檢測(cè)方法參照Gao等［19］.根據(jù)ELISA的檢測(cè)結(jié)果，選擇效價(jià)較高，且相對(duì)比較集中的第七、九和十一共3個(gè)批次的抗體凍干粉等量混合，用無菌水稀釋成100μg／μL溶液后用于western blot檢測(cè).5種蛇毒蛋白用12%分離膠在Mini Protean III sys-tem（Bio-Rad）電泳系統(tǒng)中進(jìn)行SDS-PAGE 分離.電泳結(jié)束后，膠上蛋白經(jīng)半干轉(zhuǎn)印至PVDF 膜（0.45 μm）上，隨后用含2%脫脂奶粉的PBST 溶液在4 ℃中封閉過夜.封閉結(jié)束后，PVDF膜經(jīng)PBST 漂洗，與適量體積的上述IgY 抗體溶液（1∶1 000稀釋）在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育1h.溫育結(jié)束后，用PBST 漂洗去除未結(jié)合的抗體，隨后加入HRP標(biāo)記的驢抗雞IgY／IgG 二抗（1∶5 000稀釋），在37 ℃下溫育1h.用PBST 洗去未結(jié)合的二抗后，將膜浸入DAB顯色液顯色直至條帶清晰可見，然后用蒸餾水終止顯色.顯色結(jié)果經(jīng)Umax2100掃描儀掃描，并用Tan4100軟件進(jìn)行分析.

2 結(jié)果

整個(gè)產(chǎn)卵過程中，動(dòng)物并未出現(xiàn)產(chǎn)軟殼卵、畸形卵等異?，F(xiàn)象.兩只母雞中，2號(hào)雞的產(chǎn)卵周期較為規(guī)律，但產(chǎn)卵周期明顯偏長(zhǎng)，且卵重較1號(hào)雞輕5g左右；1號(hào)雞的產(chǎn)卵周期無明顯規(guī)律，但產(chǎn)量略高于2號(hào)雞.從第55天開始兩只雞產(chǎn)卵量明顯減少，且產(chǎn)卵周期較不規(guī)律.

ELISA 評(píng)估了免疫前后各批次卵黃抗體效價(jià)變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著免疫時(shí)間的增加，卵黃中抗體含量逐漸增加，凍融法、水稀釋法和PEG 法3種抽提法中抗體含量的變化趨勢(shì)大致相同，但個(gè)別階段的含量依然存在較大的波動(dòng)（圖1）.前10d的抗體含量普遍較低，隨后快速增加，到40～60d抗體含量達(dá)到最高值，之后呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì).根據(jù)ELISA 檢測(cè)結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)5種蛇毒與卵黃IgY 的交叉反應(yīng)程度也不同（圖1）.其中，短尾蝮與IgY 免疫反應(yīng)強(qiáng)度在第10天左右就開始快速增加，其余4種蛇毒與IgY 反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間大致相同，均在第15天左右開始增加；除凍融法所得IgY 與短尾蝮和烏蘇里蝮蛇毒出現(xiàn)較高的反應(yīng)強(qiáng)度外，其它兩種抽提法所得IgY 與蛇毒免疫反應(yīng)的強(qiáng)度大體一致（圖1）.3種抽提法所得抗體效果略有差異，且抗體含量并非呈現(xiàn)均勻的變化趨勢(shì)，期間存在突然升高或降低的情況，但不影響總體趨勢(shì)的判斷，均可用Log Normal四參曲線公式擬合抗體IgY 免疫期間誘導(dǎo)量的變化趨勢(shì)（圖1）.

圖1 免疫過程中雞卵黃抗蛇毒IgY的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 The dynamic change of chicken egg yolk IgY against venoms during the immunization

SDS-PAGE結(jié)果顯示，5種蛇毒蛋白的主要成分集中在中低分子量區(qū)域（約43～58，22～26kDa），此外還含有少量的高分子（約130kDa）和低分子（約14kDa）組分（圖2A）.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)制備的雞卵黃抗蛇毒IgY 和5種蛇毒之間存在不同程度的免疫交叉反應(yīng)，且反應(yīng)區(qū)域與蛇毒分子量條帶區(qū)相對(duì)應(yīng)（圖2B～D）.巖棲蝮、短尾蝮和烏蘇里蝮3種蛇毒與IgY 的反應(yīng)強(qiáng)度基本相似，其中，短尾蝮和烏蘇里蝮蛇毒蛋白幾乎所有條帶呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的免疫原性，巖棲蝮僅有少量蛇毒組分未呈現(xiàn)免疫原性，這些組分主要集中在低分子量條帶區(qū)（約14～25kDa），3種抽提法所得抗體與這3種蛇毒反應(yīng)的效果接近.原矛頭蝮和菜花原矛頭蝮與IgY 也表現(xiàn)出相似的反應(yīng)強(qiáng)度，但與前3種蛇毒相比，這兩種蛇毒顯示出較低的免疫原性，僅有少數(shù)蛋白條帶能被IgY 抗體識(shí)別.且不同抽提法所得IgY 抗體對(duì)原矛頭蝮和菜花原矛頭蝮蛇毒的識(shí)別能力也存在差異，凍融法與水稀釋法所得抗體可識(shí)別原矛頭蝮蛇毒中約20、25、45和130kDa的組分，而PEG 法只能識(shí)別位于分子量約45和130kDa區(qū)域的蛋白條帶.3種抽提法所得IgY抗體與5種蛇毒的反應(yīng)顯示，分子量約45和130kDa附近的蛇毒組分可被抗體有效識(shí)別，且表現(xiàn)較高的識(shí)別強(qiáng)度.

圖2 Western blot檢測(cè)雞卵黃抗蛇毒IgY與5種蛇毒免疫反應(yīng)Fig.2 Cross-reaction between egg yolk IgY and venoms from five species by western blot

3 討論

本研究所用兩只萊航母雞的產(chǎn)卵規(guī)律存在一定差異，這可能與動(dòng)物自身狀態(tài)存在一定差異有關(guān).實(shí)驗(yàn)期間，一只母雞狀態(tài)良好，另一只則稍顯精神不濟(jì)、雞冠略有下垂，但無明顯病癥.兩只雞產(chǎn)卵周期不同，都存在明顯的斷檔期.筆者發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)期間兩只雞攝取飼料都不是很積極，對(duì)產(chǎn)卵造成一定影響；加之后期更換了飼料，造成其不適，產(chǎn)卵數(shù)量下降明顯；此外，母雞在注射蛇毒類毒素后存在一定的不適性，也可能影響產(chǎn)卵.這對(duì)后期的實(shí)驗(yàn)造成一定影響，因此在抗體提取過程中，人為設(shè)置周期合并雞卵，以彌補(bǔ)上述缺陷.

用蛇毒類毒素免疫產(chǎn)卵母雞可誘導(dǎo)出相應(yīng)的抗蛇毒免疫蛋白，由于卵黃沉積作用，可在產(chǎn)出的雞卵中檢出這些抗蛇毒免疫蛋白，且連續(xù)對(duì)母雞進(jìn)行加強(qiáng)免疫，可使抗蛇毒免疫蛋白誘導(dǎo)量保持穩(wěn)定水平［20］.本研究中由5種蛇毒混合物制備的類毒素免疫萊航母雞被證實(shí)可誘導(dǎo)出卵黃多價(jià)抗蝮蛇毒IgY.ELISA 結(jié)果顯示前10d抗體含量較低，這是由于動(dòng)物接受免疫時(shí)間較短，對(duì)抗原的免疫應(yīng)答還未明顯體現(xiàn)出來.第11、21和31天進(jìn)行了加強(qiáng)免疫，免疫效果明顯，抗體含量快速增加，40～60d達(dá)到最高峰；之后因?yàn)橥Ｖ姑庖?，故雞卵黃中的抗體含量逐漸減少.實(shí)驗(yàn)所得的卵黃抗蛇毒IgY 對(duì)不同種蛇毒的識(shí)別能力存在一定差異.短尾蝮蛇毒誘導(dǎo)IgY 抗體的速度與含量要明顯優(yōu)于其它4種蛇毒，考慮到實(shí)驗(yàn)所用的類毒素是由5種蛇毒等質(zhì)量混合的，因此可以推測(cè)蛇毒對(duì)萊航母雞的免疫刺激應(yīng)存在較大的種間差異.此外，亞洲蝮屬（短尾蝮、烏蘇里蝮和巖棲蝮蛇）蛇毒對(duì)母雞的免疫刺激要強(qiáng)于原矛頭蝮屬（原矛頭蝮和菜花原矛頭蝮）蛇毒，表明蛇毒對(duì)母雞的免疫刺激存在屬間差異.

Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種抽提法所得抗體對(duì)蛇毒的識(shí)別效果基本相似，僅有原矛頭蝮和菜花原矛頭蝮蛇毒部分條帶（約20、25kDa）只能被凍融法和水稀釋法所得抗體識(shí)別，而無法被PEG 法所得抗體識(shí)別，這可能是因?yàn)镻EG 法在提取抗體過程中，體系比較粘稠，在離心管和透析袋上殘留過多，導(dǎo)致相應(yīng)抗體成分的損耗.Western blot結(jié)果表明蛇毒與IgY 反應(yīng)存在顯著的屬間差異，且亞洲蝮屬蛇毒的反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于原矛頭蝮屬蛇毒，印證了與ELISA 檢測(cè)相同的結(jié)論，可見母雞對(duì)亞洲蝮屬蛇毒的免疫應(yīng)答要強(qiáng)于原矛頭蝮屬蛇毒.親緣關(guān)系較近物種蛇毒間具有較多的共同抗原組分，所誘導(dǎo)出的抗體能夠識(shí)別相近物種中較多的蛇毒組分［19］.用短尾蝮蛇毒制備的國(guó)產(chǎn)商用抗蝮蛇毒血清能較大程度地識(shí)別短尾蝮、烏蘇里蝮和巖棲蝮3種蛇毒中的主要組分，但僅能識(shí)別原矛頭蝮蛇毒中約14、20、40～50和130kDa區(qū)域的組分［21］，可見原矛頭蝮蛇毒中其它分子量區(qū)域與蝮蛇毒不具有共同抗原組分.因此，本研究中5種蛇毒可被IgY 共同識(shí)別的組分（約45和130kDa），表明兩屬毒蛇的蛇毒僅少量組分具有共同的抗原表觀識(shí)別位點(diǎn)，可誘導(dǎo)出共同抗體.另一方面，western blot結(jié)果顯示，原矛頭蝮屬蛇毒中大量組分無法被IgY 識(shí)別，可能還意味著這些組分不易或無法引起萊航母雞的免疫應(yīng)答.

根據(jù)上述抗原抗體免疫反應(yīng)的結(jié)果，可初步推斷本研究制備之卵黃多價(jià)抗蛇毒IgY 與傳統(tǒng)多價(jià)抗蛇毒血清具有相似的作用特點(diǎn)，但對(duì)不同蛇毒的作用存在較大的屬間差異.對(duì)于亞洲蝮屬3種毒蛇來說，在無法明確患者受何種咬傷時(shí)，這種卵黃多價(jià)抗蛇毒IgY 可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值；對(duì)原矛頭蝮屬兩種毒蛇來說，由于這種卵黃多價(jià)抗蛇毒IgY 對(duì)兩種蛇毒識(shí)別能力較弱，其應(yīng)用價(jià)值要低得多，仍有待進(jìn)一步改進(jìn).此外，對(duì)于卵黃抗體IgY 的實(shí)際應(yīng)用，可能還要較多地考慮到患者的過敏反應(yīng)，這還將涉及IgY 的改造等工序，需要深入展開相關(guān)研究.

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