沈嘉希，劉阿娟，楊俊林

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310036）

脊髓損傷之后損傷區(qū)域周圍活躍的星形膠質(zhì)細(xì)胞將會(huì)形成膠質(zhì)疤痕［1］，很大程度上阻礙了脊髓損傷后神經(jīng)元的修復(fù)［2］，此外，損傷以后微環(huán)境將發(fā)生劇烈的變化，且各類免疫細(xì)胞會(huì)釋放多種因子.本研究旨在探索這些微環(huán)境的變化對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（Oligodendrocyte progenitor cells，OPCs）發(fā)育的影響.PDGFRa是血小板源性生長(zhǎng)因子受體家族的一員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，PDGFRa只表達(dá)在未分化的OPCs中［3］.體內(nèi)試驗(yàn)表明，PDGFRa敲除的小鼠中OPCs的增殖受到明顯抑制而分化提前［4］.因此，PDGFRa被認(rèn)為是比較好的OPCs的標(biāo)記分子.

脊髓損傷目前還沒(méi)有非常有效的治療方案，現(xiàn)有主要的治療方案包括干細(xì)胞移植［5］或誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，IPSC）移植［6］、重編程損傷區(qū)域中的星形膠質(zhì)細(xì)胞［7］等.移植后的OPCs主要分化形成星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此通過(guò)觀察損傷區(qū)域微環(huán)境的變化對(duì)OPCs發(fā)育的影響，對(duì)移植OPCs／OLs（Oligodendrocyte cells，少突膠質(zhì)細(xì)胞）治療脊髓損傷具有參考價(jià)值.本研究利用PDGFRa-creER小鼠和Rosa-tdTomato小鼠品系在特定時(shí)間內(nèi)來(lái)示蹤損傷后OPCs細(xì)胞的去向：在脊髓損傷前5d予以腹腔注射藥物Tomaxifen［8］，誘導(dǎo)tdTomato 的表達(dá)，標(biāo)記損傷前的PDGFRa陽(yáng)性細(xì)胞在脊髓損傷后的轉(zhuǎn)變.

1 材料和方法

1.1 小鼠及主要試劑

PDGFRa-creER＋／-小鼠購(gòu)買自Jackson lab.Rosa-tdTomato＋／＋小鼠由杭州師范大學(xué)發(fā)育與再生研究所劉陽(yáng)老師實(shí)驗(yàn)室提供.PBS、慶大霉素購(gòu)自美國(guó)Gicbco公司.山羊血清和蔗糖購(gòu)自美國(guó)Invitrgen公司.包埋劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司.0.1%Triton、氫氧化鈉和Tris-HCl購(gòu)自上海生工.戊巴比妥鈉、多聚甲醛（PFA）和戊二醛購(gòu)自美國(guó)Sigma公司.抗體為anticc1（Abcam，AB16794），antiPDGFRa（Abcam，AB61219），antiGFAP（Millipore，AB5804）.

1.2 Tomaxifen誘導(dǎo)小鼠

得到PDGFRa-creER／Rosa-tdTomato小鼠后的第25天時(shí)，對(duì)小鼠注射40mg／mL 的Tomaxifen溶液（溶劑為95%的植物油和5%的無(wú)水乙醇）0.1mL，連續(xù)注射5d.

1.3 損傷小鼠脊髓

在小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，待小鼠麻醉后，將脊髓T7～T10之間的表皮去毛，剪開背部皮膚，在手術(shù)顯微鏡下取出小鼠T8或T9區(qū)域脊髓背側(cè)的骨頭，在脊髓損傷儀下進(jìn)行損傷.損傷后用手術(shù)線將傷口縫合，并在損傷處留下一小段手術(shù)線作為標(biāo)記.最后在腹腔注射慶大霉素，降低術(shù)后感染.

1.4 處理小鼠脊髓

先將小鼠麻醉，剪開小鼠腹腔到胸腔處，露出心臟，將PBS用泵注入右心室，并把左心房剪個(gè)小口子，當(dāng)肝臟顏色退去后，改注射4%的PFA.待小鼠全身肌肉僵硬后，取出損傷段脊髓置于冰上，在PBS中將脊髓取出，放入4%的PFA 中在4 ℃冰箱過(guò)夜固定.第二天用30%的蔗糖溶液替換PFA 溶液對(duì)脊髓進(jìn)行脫水.在包埋材料前，將包埋劑在冰上預(yù)冷，錫箔紙折成正方形后放在干冰上并將包埋劑加入錫箔紙內(nèi)，然后迅速把脊髓垂直底面放入包埋劑內(nèi)，等包埋劑凝固后放入-80 ℃冰箱保存.包埋好的材料在冰凍切片機(jī)上切片（厚度為14μm），貼完材料的玻片放入片盒在-80 ℃冰箱保存.

1.5 免疫熒光

將脊髓組織切片放入PBS洗5min，重復(fù)3次.5%的山羊血清室溫封閉30min，按稀釋比例加入一抗，放入水盒在4 ℃過(guò)夜.第二天取出片子后繼續(xù)用PBS洗5min，重復(fù)3次，加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h.最后用PBS洗3遍，每次5min，封片，在熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下照相.

1.6 電鏡

剖開小鼠胸腔后，用含有戊二醛的PB進(jìn)行灌注，取出損傷區(qū)域，放在PB 中保存.在浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院電鏡公共平臺(tái)進(jìn)行后期處理，在鋨酸中脫水，然后依次在由低到高不同濃度梯度的乙醇中脫水.包埋劑包埋后定位損傷部位，之后對(duì)材料超薄切片，電子顯微鏡下照相.

2 結(jié) 果

2.1 小鼠Tomaxifen作用下的誘導(dǎo)效率

為了探究PDGFRa陽(yáng)性細(xì)胞在小鼠脊髓損傷后的變化，選用基因型為PDFGRa-creER／Rosa-tdTomato的小鼠作為研究對(duì)象，在兩個(gè)不同的時(shí)期通過(guò)腹腔注射Tomaxifen誘導(dǎo)Cre的表達(dá)起到示蹤的作用.選取小鼠出生后第15天（P15）和第30天（P30）兩個(gè)時(shí)期作為參照.PDGFRa陽(yáng)性細(xì)胞隨著小鼠的發(fā)育逐漸減少（圖1），PDGFRa和tomato的信號(hào)符合本研究要求（P＜0.05）.

圖1 Tomaxifen誘導(dǎo)下tdTomato可以正常表達(dá)Fig.1 The expression of the tomato under the action of Tomaxifen

2.2 小鼠脊髓損傷后損傷區(qū)域的修復(fù)

本研究選擇在小鼠P30時(shí)期做損傷實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期小鼠脊髓中PDGFRa陽(yáng)性細(xì)胞處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)，并且細(xì)胞的分裂活性較高.用50Kdynes損傷小鼠脊髓T8或T9段后，小鼠會(huì)在一段時(shí)間后恢復(fù)部分行動(dòng)能力，在該條件下能觀察小鼠脊髓的自我修復(fù).本研究在P30時(shí)期損傷后，繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠一個(gè)月后取材，電鏡觀察（圖2）可見(jiàn)：在物理?yè)p傷情況下，大部分的髓鞘都已消失，很多神經(jīng)元在損傷下死亡.以喂酮腙實(shí)驗(yàn)作為比較，28d連續(xù)喂飼小鼠酮腙后，取胼胝體在電鏡下觀察，藥物并不能非常干凈地脫髓鞘，會(huì)有少許的殘留，而物理?yè)p傷的情況則比較嚴(yán)重.

脊髓損傷后會(huì)形成許多的膠質(zhì)疤痕，對(duì)野生型的P30小鼠脊髓傷后30d取材，通過(guò)免疫熒光染GFAP抗體后確定損傷區(qū)域（圖3）.膠質(zhì)疤痕主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等組成，會(huì)阻礙神經(jīng)元軸突的再生和髓鞘的修復(fù)［1］.

圖2 物理?yè)p傷和酮腙作用下脫髓鞘的情況Fig.2 The effect of physical injury and ketone hydrazone demyelinating

圖3 物理?yè)p傷后形成的膠質(zhì)疤痕Fig.3 The glial scar under the physical injury

圖4 大部分tdTomato陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)CC1Fig.4 The tomato positive cells express CC1

2.3 PDGFRa陽(yáng)性細(xì)胞在損傷后的表達(dá)

PDGFRa主要表達(dá)在OPCs以及更早期的膠質(zhì)祖細(xì)胞等，本研究對(duì)PDFGRa-creER／Rosa-tdTomato小鼠在P25時(shí)期腹腔注射Tomaxifen，在P30時(shí)期進(jìn)行脊髓損傷，并在損傷后休養(yǎng)30d恢復(fù)部分活動(dòng)能力后取材.通過(guò)免疫熒光染少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白CC1后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)tdTomato陽(yáng)性的細(xì)胞表達(dá)CC1（圖4）.說(shuō)明在損傷以后，大部分的PDGFRa陽(yáng)性細(xì)胞分化成為少突膠質(zhì)細(xì)胞，參與形成髓鞘.

此外，極少數(shù)tdTomato陽(yáng)性的細(xì)胞不表達(dá)CC1（圖5）.筆者認(rèn)為這些細(xì)胞可能是新形成的星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此做了針對(duì)GFAP免疫熒光.在激光共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有極少數(shù)tdTomato陽(yáng)性細(xì)胞的確表達(dá)GFAP（圖6），表明在脊髓損傷后，有極少部分PDGFRa陽(yáng)性的細(xì)胞參與形成了星形膠質(zhì)細(xì)胞.

圖5 CC1-／tdTomato＋的細(xì)胞Fig.5 The CC1negative and the tdTomato positive cells

圖6 GFAP＋／tdTomato＋的細(xì)胞Fig.6 The GFAP positive and tdTomato positive cells

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在損傷后的一個(gè)月，PDGFRa陽(yáng)性的OPCs及其子代細(xì)胞主要分化成為CC1陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞，這表明，PDGFRa陽(yáng)性的細(xì)胞在損傷后主要參與髓鞘的修復(fù)，但是仍然有少部分PDGFRa陽(yáng)性的細(xì)胞在損傷后參與分化成為GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞.小鼠脊髓損傷后體內(nèi)微環(huán)境發(fā)生了極大的改變，在各類免疫細(xì)胞釋放的因子作用下，影響了少數(shù)OPCs的正常成熟途徑.在體外實(shí)驗(yàn)中，OPCs可以分化成為星形膠質(zhì)細(xì)胞［9］，但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，還未探索是否存在這條途徑.

以往的研究［10］表明，使用軟磷脂對(duì)小鼠脫髓鞘后，部分PDGFRa陽(yáng)性細(xì)胞形成施旺細(xì)胞并分化成髓鞘，也有一些PDGFRa陽(yáng)性的細(xì)胞表達(dá)GFAP信號(hào).物理?yè)p傷或使用軟磷脂脫髓鞘后，體內(nèi)微環(huán)境發(fā)生改變，使少部分OPCs細(xì)胞的命運(yùn)發(fā)生了改變.因此通過(guò)比較正常脊髓微環(huán)境和損傷后微環(huán)境的差別，可以尋找出影響OPCs發(fā)育的因素，這為今后提高干細(xì)胞移植或OPCs在治療脊髓損傷時(shí)分化成為OLs的效率、抑制移植的細(xì)胞分化成為星形膠質(zhì)細(xì)胞提供了應(yīng)用基礎(chǔ).

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