張 君，羅雅麗，童 濤，葉陸青，許 巧，陸文怡，姜 華，薛大偉

（1.杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州310036；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，浙江 杭州310021）

水稻是重要的禾谷類糧食作物，全世界有近1／2的人口依賴水稻作為主要的卡路里來源［1］.因此水稻產(chǎn)量的穩(wěn)定具有重要的社會價值和戰(zhàn)略意義［2］.稻瘟病是水稻上的一種毀滅性病害［3］，世界上栽培水稻的地區(qū)均有發(fā)生，每年給水稻造成11%～30%的產(chǎn)量損失［4-5］.

目前為止，已鑒定了80多個稻瘟病抗性基因［6］，其中有40個被定位［7］，有22個通過圖位克隆等方法被成功克隆，但由于稻瘟病菌群體多變、水稻品種抗性易喪失等諸多因素［8］，水稻抗性品種在長期生產(chǎn)上仍面臨著巨大障礙.稻瘟病的病原菌為子囊菌（Magnaporthegrisea（Hebert）Barr），除了從葉、莖等地表部位侵入水稻外，稻瘟病菌還能從根部侵入水稻植株，引發(fā)同樣的癥狀［9］.但目前對稻瘟菌侵染及影響水稻根部的生理生化及分子機理研究較少.本研究利用稻瘟病菌粗毒素處理麗江新團黑谷和谷梅二號的幼苗根部，對其生理生化和病害防衛(wèi)相關(guān)基因進行定量分析研究，為進一步了解稻瘟菌對水稻根部的感染機制及相關(guān)分子機理提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試品種及水稻幼苗培養(yǎng)

本實驗以稻瘟病敏感品種麗江新團黑谷和抗性品種谷梅二號為研究對象.水稻種子經(jīng)過浸種、催芽后，挑選96粒發(fā)芽良好種子，播種在剪掉管底的96孔板中，放入光照培養(yǎng)箱水培，培養(yǎng)液采用國際水稻所（IRRI）推薦的水培營養(yǎng)液配方.水稻苗在兩葉一心時期備用.

1.2 水稻苗期稻瘟菌粗毒素處理

實驗用稻瘟病接種菌株為Guy11.挑取稻瘟病菌Guy11菌絲于山口富夫培養(yǎng)液，25 ℃避光振蕩（150 r／min）培養(yǎng)7～12d后，將培養(yǎng)液用無菌紗布過濾，離心取上清液并高壓濕熱滅菌，得到粗毒素原液［10-12］.將原液稀釋成1／4的粗毒素處理液，在恒溫培養(yǎng)箱中分別處理麗江新團黑谷和谷梅二號活體水稻苗根部0、6、12、24、48h.分別取地上部和地下部，放入-80℃?zhèn)溆茫?1，13］.

1.3 水稻生理生化指標測定

稱取0.3g水稻葉鮮樣加8mL 0.05mol／L（pH 7.8）的PBS于冰浴中研磨，研磨樣品放入15mL離心管，4℃下10 000r／min離心20min，取上清液用于過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量測定，所有測定重復3次.MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸分光光度法；SOD 活性測定采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）光化還原法；POD 活性測定采用愈創(chuàng)木酚氧化法；CAT 活性測定采用紫外吸收法.用SHIMADZU UV-2410PC分光光度計酶動力學軟件測定吸光度的變化.

1.4 水稻RNA提取與熒光定量分析

RNA 提取采用Invitrogen公司的Trizon試劑.總RNA 在經(jīng)過Invitrogen公司DNA 酶消化試劑盒處理后進行反轉(zhuǎn)錄.cDNA 第一鏈反轉(zhuǎn)錄利用Takara公司的AMV 反轉(zhuǎn)錄酶進行，具體實驗步驟參考廠家說明.反轉(zhuǎn)錄完成后，將cDNA 保存于-80 ℃?zhèn)溆?熒光定量實驗在ABI公司7500型Real-time PCR儀中進行.采用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達量［14］.

2 結(jié) 果

2.1 稻瘟菌毒素處理不同時間的生理生化表現(xiàn)

為了解不同時間內(nèi)稻瘟菌毒素侵染水稻根部后，水稻各項生理指標的變化情況，本研究分別對麗江新團黑谷和谷梅二號兩個水稻品種進行了不同時間的處理.結(jié)果表明：在不同取樣時間，各處理水稻根部的SOD 活性都表現(xiàn)出了不同程度的升高（圖1A），且麗江新團黑谷的SOD 活性總體要高于谷梅二號.在兩個品種中，POD 活性在毒素處理不同時間后表現(xiàn)出顯著的差異，除麗江新團黑谷葉部POD 活性在處理后相對對照組普遍下降外，其他處理都有所增大（圖1B）.

圖1 稻瘟菌毒素處理下不同生理指標分析Fig.1 Analysis of physiological indices of rice under blast fungus toxin stress

CAT 的活性在處理不同時間后的變化如圖1C 所示，麗江新團黑谷葉部CAT 活性隨著時間的延長先下降后升高，而谷梅二號葉部CAT 活性隨著時間的延長則普遍顯著增加.另外，兩品種根部的CAT 活性都表現(xiàn)為隨著時間的延長先降低后增加，且兩品種葉部的CAT 活性明顯高于根部.植物體內(nèi)過?；钚匝踝杂苫梢l(fā)膜脂過氧化作用，MDA 是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其積累是活性氧毒害作用的表現(xiàn)，因而可以作為植物膜脂發(fā)生過氧化反應的強弱指標［15］.在本研究中，隨著取樣時間的延長，MDA 在兩個水稻品種中都發(fā)生了顯著積累，且兩品種根部的MDA 含量都隨著時間的延長而增加.比較兩品種MDA 含量的變化，兩者根部的變化相差不大，而其葉部含量相差較大（圖1D）.

2.2 水稻病害防衛(wèi)相關(guān)基因的表現(xiàn)

植物對病害的防衛(wèi)反應主要依賴水楊酸和茉莉酸／乙烯介導的分子信號傳導途徑［16-17］.為了解麗江新團黑谷和谷梅二號兩個水稻品種的抗性相關(guān)基因在不同處理時間下的表現(xiàn)，本研究共對8個病害防衛(wèi)相關(guān)基因（表1）進行了熒光定量PCR 分析，結(jié)果如圖2所示.

表1 Real time-PCR 引物序列Tab.1 Prime sequences used in real time-PCR

圖2 稻瘟菌毒素處理下幼苗葉和根中相關(guān)基因的相對表達量Fig.2 The relative expression of genes in the rice seedling under blast fungus toxin stress

PR1b是病程相關(guān)蛋白基因，在植物中主要抑制病原菌的生長、繁殖和傳播.毒素處理后，PR1b基因在谷梅二號中的相對表達量明顯高于稻瘟病敏感品種麗江新團黑谷，在24和48h的表達量分別達到最大，這可能是毒素處理時間的增加誘導PR1b基因表達量大增所致.PR4基因的表達在麗江新團黑谷和谷梅二號中與PR1b類似.PR1a卻不同，雖然隨著處理時間的增加，表達量在兩品種中均總體上升，但在48 h時，PR1a在麗江新團黑谷根中的表達量高于谷梅二號.而另一個病程相關(guān)蛋白基因JIOsPR10在敏感品種麗江新團黑谷中的表達量先上升后下降，在48h時降到最低，在根和葉中檢測不到；而在谷梅二號的葉中，48h時表達量達到最大，根中的表達量則隨著處理時間的增加基本無變化（圖2）.

與水楊酸合成相關(guān)的苯丙氨酸裂解酶基因PAL在稻瘟病抗性品種谷梅二號幼苗根和葉中的表達水平均顯著增高，48h時其在根中的表達量是未處理時的8倍.PAL在敏感品種麗江新團黑谷根和葉中的表達量呈波浪狀，表達不穩(wěn)定.β-1，3-葡聚糖酶類似基因Gns1的表達量在兩個品種中隨著處理時間的延長，均呈上升趨勢，且在麗江新團黑谷葉中的表達量高于抗性品種谷梅二號.幾丁質(zhì)酶基因Cht-1的表達量在毒素處理后期均升高，48h時，兩品種葉中的表達量差異不大，但谷梅二號根中的表達量高于麗江新團黑谷.查爾酮合成酶基因CHS的表達量與Gns1類似，隨著處理時間的延長，在兩個品種中均呈上升趨勢且差異不大（圖2）.

3 討 論

稻瘟病是影響水稻生產(chǎn)的主要病害，本研究以稻瘟菌毒素侵染水稻幼苗根部，通過生理分析及相關(guān)基因的熒光定量分析來研究稻瘟菌感染水稻根部的分子機理，以期為深入了解水稻病害的根部感染機制奠定一定的基礎(chǔ).

植物不能像動物一樣移動，因此面對逆境需要消耗大量能量主動應對.這種植物對逆境的主動應對在分子層面表現(xiàn)為復雜的脅迫應答及調(diào)控機制［6］.此外，這些精巧的調(diào)控機制將最終調(diào)動相關(guān)生理指標的變化.在本研究中，不同處理生理指標的變化并不完全相同.就SOD 來說，在不同處理間的變化非常微妙，沒有顯著性的改變.而其它3個生理指標變化都非常劇烈，且呈現(xiàn)一定處理相關(guān)性，具有基因型差異.

前人的研究表明，植物對病害和機械損傷的防御主要通過SA 和JA／乙烯信號傳導途徑介導［18］.本研究所選取的8個抗性相關(guān)基因中，PR1a、PAL、Cht-1和PR4主要涉及水楊酸通路，JIOsPR10則主要與茉莉酸通路相關(guān)，PR1b與水楊酸和茉莉酸都相關(guān)［19］，CHS和Gns1則可能與茉莉酸通路有關(guān).研究結(jié)果顯示，稻瘟菌毒素處理水稻幼苗根部后，防衛(wèi)信號傳導途徑被激活.稻瘟病抗性水稻的防衛(wèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平在處理后期明顯高于敏感水稻，最顯著的標志是水楊酸途徑中的關(guān)鍵基因PAL在48h時根中的表達量是麗江新團黑谷的8倍.同樣，處理后期時病程相關(guān)蛋白JIOsPR10、PR1b和PR4在抗性水稻中的表達量也遠高于敏感水稻，其中PR1b和PR4是在根中，而JIOsPR10是在葉中.

植物防御反應的調(diào)控非常復雜，SA 和JA／乙烯介導的防衛(wèi)途徑之間的分工尚不明確.植物在其整個生活史中既要應對昆蟲的取食危害，又要抵御病原菌的侵染.因此植物在長期的進化過程中，體內(nèi)同時保留了依賴SA 介導和依賴JA 介導的信號傳導途徑，并通過調(diào)節(jié)SA 和JAs的含量來準確調(diào)控這兩個途徑［20］.本研究中，稻瘟菌毒素處理后，這兩個途徑中的相關(guān)基因或關(guān)鍵基因與本底水平相比都表現(xiàn)出上調(diào)或下調(diào)的趨勢，說明兩個途徑都得到了表達.植物的防衛(wèi)基因還包括幾丁質(zhì)酶基因、β-1，3-葡聚糖酶基因及病程相關(guān)蛋白基因等［21］.本研究針對水稻的主要防衛(wèi)途徑——SA 和JA／乙烯信號傳導途徑中的8個相關(guān)基因如苯丙氨酸解氨酶基因、幾丁質(zhì)酶基因以及病程相關(guān)蛋白等基因進行了轉(zhuǎn)錄水平上的定量分析，為水稻根部稻瘟病毒素誘導的抗性機制研究奠定了基礎(chǔ).

［1］Khush G S.Challenges for meeting the global food and nutrient needs in the new millennium［J］.Proceedings of the Nutrition Society，2001，60（1）：15-26.

［2］De Datta S K.Principles and practices of rice production［M］.New York：Wiley-Interscience Publications，1981.

［3］Wilson R A，Talbot N J.Under pressure：investigating the biology of plant infection byMagnaportheoryzae［J］.Nature Reviews Microbiology，2009，7（3）：185-195.

［4］Liu Z L，Lei C L，Cheng Z J，etal.Progress on genetic mapping and gene cloning of rice blast resistance［J］.Journal of Crop，2007（3）：16-19.

［5］孫國昌，杜新法，陶榮祥，等.水稻稻瘟病防治研究進展和21世紀初研究設(shè)想［J］.植物保護，2000，26（1）：34-36.

［6］Yang Q Z，Lin F，F(xiàn)eng S J，etal.Recent progress on molecular mapping and cloning of blast resistance genes in Rice（OryzasativaL.）［J］.Scientia Agricultura Sinica，2009，42（5）：1601-1615.

［7］Asikawa I，Hayashi N，Yamane H，etal.Two adjacent nucleotide-binding site-leucine-rich repeat class genes are required to conferPikm-specific rice blast resistance［J］.Genetics，2008，180（4）：2267-2276.

［8］伍尚中，朱小源，劉斌，等.秈稻品種三黃占2號的稻瘟病持久性評價與遺傳分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2004，37（4）：528-534.

［9］Sesma A，Osbourn A E.The rice leaf blast pathogen undergoes developmental processes typical of root-infecting fungi［J］.Nature，2004，431（7008）：582-586.

［10］陳罡，鐘鳴，侯玉柱，等.稻瘟病菌粗毒素的致病力測定及其對水稻幼苗生理生化的影響［J］.種子，2006，25（5）：20-23.

［11］劉文萍，劉麗艷，呂曉波，等.稻瘟病菌粗毒素的制備及其致病力的測定［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學，1997（6）：15-17.

［12］王金陵，許文耀，王允義.稻瘟病菌粗毒素的制備及其對水稻毒性的測定［J］.福建農(nóng)學院學報，1988，17（4）：318-322.

［13］鄭秋玲.稻瘟病毒素對水稻根冠活細胞的影響研究［J］.安徽農(nóng)學通報，2007，13（4）：125-126.

［14］Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［15］Salin M L.Toxic oxygen species and protective systems of the chloroplast［J］.Physiologia Plantarum，1988，72（3）：681-689.

［16］Li Q，Xie Q G，Smith-Becker J，etal.Mi-1-mediated aphid resistance involves salicylic acid and mitogen-activated protein kinase signaling cascades［J］.Mol Plant Microbe Interact，2006，19（6）：655-664.

［17］Walling L L.The myriad plant responses to herbivores［J］.J Plant Growth Regul，2000，19：195-216.

［18］Ryan C A.Protease inhibitors in plants：genes for improving defenses against insects and pathogens［J］.Annual Review of Phytopathology，1990，28：425-449.

［19］Shen Q H，Saijo Y，Mauch S，etal.Nuclear activity of MLA immune receptors links isolate-specific and basal disease resistance responses［J］.Science，2007，315（5815）：1098-1103.

［20］Peng J Y，Huang Y P.The signaling pathways of plant defense response and their interaction［J］.Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2005，31（4）：347-353.

［21］Dixon R A，Harrison M J，Lamb C J.Early events in the activation of plant defense responses［J］.Annu Rev Phytopathol，1994，32（1）：479-501.