齊麟 李軍 向志明 余英才

4.江西中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室，南昌 ?330004）

摘要：通過(guò)構(gòu)建斑馬魚(yú)（Danio rerio）SAA原核表達(dá)載體，在大腸桿菌（E.coli）TB1中誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得了斑馬魚(yú)SAA融合蛋白，將純化的斑馬魚(yú)SAA蛋白免疫Balb/c小鼠，制備了特異性多克隆抗血清，并研究了斑馬魚(yú)SAA融合蛋白與細(xì)菌的結(jié)合能力及檢測(cè)了抗體效價(jià)。結(jié)果表明，純化的斑馬魚(yú)融合SAA蛋白能夠與5種細(xì)菌直接結(jié)合，血清效價(jià)達(dá)到1∶2 000以上。

關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)（Danio rerio）;血清淀粉樣蛋白A;原核表達(dá);抗體制備;菌結(jié)合

中圖分類號(hào)：Q789 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0382-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.031

Prokaryotic Expression， Antibody Preparation and Bacteria Combining of

SAA Protein in Zebrafish

QI Lin1，LI Jun2，XIANG Zhi-ming3，YU Ying-cai4

（1.Railway Police College， Zhengzhou 450053， China; 2. School of Pharmaceutical， Liaocheng University， Liaocheng 252000， Shandong， China; 3.South China Sea Institute of Oceanology， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510301， China;

4.Department of Biochemistry Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China）

Abstract： The SAA fusion protein in zebrafish（Danio rerio） was expressed in E.coli TB1 and purified according to the construction of prokaryotic expression vector. The specific polyclonal antibodies were raised in Balb/c mouse immunized with the purified recombinant protein. The bacteria conjugation ability and the value of polyclonal antibodies were detected. The results showed that the purified SAA protein in zebrafish was found to combine together with 5 bacteria. The value of obtained antibodies was up to 1∶2 000.

Key words： zebrafish（Danio rerio）; SAA; prokaryotic expression; antibody preparation; bacteria combining

血清樣淀粉A（Serum amyloid A， SAA）為高度異質(zhì)性蛋白[1]，因與一系列疾病相關(guān)而成為病理學(xué)研究的熱點(diǎn)。SAA基因的多態(tài)性是淀粉樣病變的高危因素，持續(xù)高水平SAA是淀粉樣病變發(fā)生的前提條件[2]。除此之外，SAA與胃癌[3]、直腸癌[4]、胰腺癌[5]、肺癌[6]和絨毛膜癌[7]等惡性腫瘤呈正相關(guān)，并將SAA作為癌癥臨床常規(guī)檢查的非特異性腫瘤標(biāo)志物以及手術(shù)后康復(fù)程度的指標(biāo)是可行的。人源SAA可以通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子1（Intercellular adhesion molecule 1， ICAM-1）的表達(dá)而募集白細(xì)胞[8]。本研究中在克隆獲得全長(zhǎng)斑馬魚(yú)（Danio rerio）SAA的基礎(chǔ)上[9]，構(gòu)建融合表達(dá)載體，在大腸桿菌TB1中表達(dá)斑馬魚(yú)SAA并進(jìn)行純化，將純化蛋白進(jìn)行菌結(jié)合試驗(yàn)并免疫Balb/c小鼠制備了特異性多克隆抗體，為后續(xù)免疫及腫瘤病理學(xué)試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

1.1.1 ?載體與菌種 ?原核表達(dá)載體pMal-c2x、大腸桿菌（E. coli）表達(dá)宿主菌TB1和Amylose Resin多糖樹(shù)脂購(gòu)自New England Biolabs公司;pGEM-T vector購(gòu)自Promega公司;大腸桿菌DH5α、野生型大腸桿菌K12、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶澡酸弧菌（V.alginolyticus）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）和表皮葡萄球菌（S.epidermidis）均為鐵道警察學(xué)院生化快速鑒別實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保種。

1.1.2 ?試劑 ?瓊脂糖膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品;T4 DNA連接酶、Taq酶、DNA marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品;蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品;堿性磷酸酶羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)安瑪西亞公司;NC膜購(gòu)自PALL公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 ?原核表達(dá)載體pMal-c2x-SAA的構(gòu)建

使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上、下游引物，以pGEM-T-SAA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中上游引物序列：5′-TTTGAATTCATGAAGCTTCTTCTTG -3′，下游引物序列：5′-TTTTCTAGATATGGGCAGG

CCTTTA-3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后和pMal-c2x空載體質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后于16 ℃連接過(guò)夜，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌TB1，-80 ℃保菌。

1.3 ?重組質(zhì)粒pMal-c2x-SAA的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

取“1.2”中的菌液0.5 mL接種到5 mL含氨芐青霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到500 mL的新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm=0.6，加入0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3 h以上，以12%的SDS-PAGE電泳分析其表達(dá)后利用Amylose Resin多糖樹(shù)脂來(lái)純化重組蛋白。

1.4 ?斑馬魚(yú)SAA蛋白的菌結(jié)合試驗(yàn)

將獲得的斑馬魚(yú)SAA純化蛋白用于細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)，具體操作見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。

1.5 ?斑馬魚(yú)SAA蛋白抗鼠血清制備

取100 μg純化的斑馬魚(yú)SAA融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，切下目的蛋白質(zhì)條帶，以去離子水反復(fù)漂洗，去除凝膠上的甲醇和冰醋酸，以pH 7.4的PBS緩沖液4 ℃浸泡過(guò)夜。于冰浴中用研缽研磨直至懸浮液中的凝膠顆粒細(xì)小而均勻，加入等體積的弗氏佐劑，繼續(xù)研磨或用注射器反復(fù)抽打使完全乳化。將1 mL用弗氏完全佐劑乳化的抗原溶液通過(guò)腹腔注射接種發(fā)育良好的純種Balb/c小鼠體內(nèi)做為基礎(chǔ)免疫，基礎(chǔ)免疫后14 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫。注射間隔周期為7 d，加強(qiáng)注射所用的抗原溶液用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化。加強(qiáng)免疫4次后采用傳統(tǒng)摘除眼球取血法采集Blab/c小鼠血液。取出的血液37 ℃保溫1 h后，4 ℃靜置過(guò)夜，5 000 r/min離心10 min后，取上清-80 ℃分裝保存。

1.6 ?斑馬魚(yú)SAA蛋白抗鼠血清效價(jià)的測(cè)定

用PBS緩沖液將抗鼠血清進(jìn)行稀釋，稀釋梯度依次為1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000。取NC膜用PBST緩沖液浸泡5 min， 晾干，取純化的蛋白1 μg點(diǎn)于膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST 緩沖液37 ℃封閉1 h，PBST緩沖液洗滌10 min（重復(fù)3次）;將膜分別用封閉液稀釋的抗血清37 ℃孵育1 h，PBST緩沖液洗滌10 min（重復(fù)3次）;用羊抗鼠IgG為二抗，37 ℃哺育1 h，PBS緩沖液洗滌10 min（重復(fù)3次），DAB顯色。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?原核表達(dá)載體pMal-c2x-SAA的構(gòu)建

使用載體構(gòu)建的特異性引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，挑選的5個(gè)克隆中有4個(gè)大小約360 bp，與預(yù)期大小相符，表明成功構(gòu)建pMal-c2x-SAA原核表達(dá)載體。

2.2 ? SAA蛋白的表達(dá)與純化

將融合表達(dá)載體pMal-c2x-SAA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 E.coli菌株TB1，用0.1 mmol/L 的IPTG 37 ℃分別誘導(dǎo)3、6 h后，菌體用12%的SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，在53 ku附近有明顯的蛋白條帶出現(xiàn)，與預(yù)期大小相同，并利用Amylose Resin多糖樹(shù)脂來(lái)純化了重組蛋白，獲得較為專一的蛋白條帶。

2.3 ?斑馬魚(yú)SAA蛋白菌結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果

使用純化的SAA融合蛋白與3種革蘭氏陰性菌（野生型大腸桿菌K12、副溶血弧菌、溶澡酸弧菌）以及2種革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）分別進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)，以誘導(dǎo)pMal-c2x空載體獲得的融合蛋白為對(duì)照，結(jié)果如圖3所示。斑馬魚(yú)SAA具有廣譜的菌結(jié)合能力，與上述5種細(xì)菌都能結(jié)合。

2.4 ?斑馬魚(yú)SAA抗小鼠多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果

取純化后的重組斑馬魚(yú)SAA蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行皮下免疫，經(jīng)過(guò)4次免疫后，從兔子耳靜脈取血制備血清，用斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（DOT-ELISA）測(cè)定抗血清效價(jià)。由圖4可知，鼠抗斑馬魚(yú)SAA血清的效價(jià)達(dá)到1∶2 000以上。

3 ?小結(jié)與討論

斑馬魚(yú)SAA蛋白具有廣譜的菌結(jié)合能力，對(duì)本試驗(yàn)所選取的5種細(xì)菌均表現(xiàn)出很強(qiáng)的吸附能力。哺乳動(dòng)物SAA蛋白一般只能對(duì)革蘭氏陰性菌有結(jié)合能力，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌無(wú)結(jié)合能力。哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)比魚(yú)類復(fù)雜得多，對(duì)不同種類的細(xì)菌表現(xiàn)出不同的免疫機(jī)制。斑馬魚(yú)屬于進(jìn)化地位較低等脊椎動(dòng)物，SAA蛋白可能擔(dān)負(fù)起對(duì)整個(gè)細(xì)菌的識(shí)別，而在哺乳動(dòng)物中，SAA蛋白功能可能被弱化和部分分離，進(jìn)化壓力脅迫對(duì)SAA蛋白功能產(chǎn)生了較大的影響。

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