蔣靜　李元文　張豐川　蔡玲玲　聶晶　李天嬌　張力元　陳雪燕　李根茂葛東宇

甘石青黛膏對大鼠亞急性濕疹模型皮損淋巴細胞和角質(zhì)形成細胞Bcl-2與Bax蛋白表達變化的影響

蔣靜李元文張豐川蔡玲玲聶晶李天嬌張力元陳雪燕李根茂葛東宇

【摘要】目的觀察甘石青黛膏對大鼠亞急性濕疹模型皮損淋巴細胞和角質(zhì)形成細胞B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白與Bax蛋白表達變化的影響，探究中藥外治濕疹的分子生物學依據(jù)。方法造模前取大鼠正常皮膚組織，制作成石蠟切片備用，造模成功后分為治療組和模型組，治療組采用中藥甘石青黛膏干預，模型組無干預，檢測三組大鼠Bcl-2與Bax蛋白表達情況。結(jié)果造模前大鼠Bcl-2與Bax蛋白表達均呈陽性，且Bcl-2/Bax比率接近于1;治療組Bcl-2蛋白表達呈弱陽性，模型組Bcl-2蛋白表達呈強陽性，兩者相比具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001);治療組Bax蛋白表達呈陽性，模型組Bax蛋白表達呈弱陽性，兩者相比具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001);治療組與模型組Bcl-2/Bax比率相比具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，后者明顯高于前者;治療組與健康組Bcl-2/Bax比率相比無統(tǒng)計學差(P＞0.05)。結(jié)論甘石青黛膏具有抑制Bcl-2蛋白表達，促進Bax蛋白表達，使細胞凋亡調(diào)控系統(tǒng)趨于平衡的作用。

【關鍵詞】甘石青黛膏; B淋巴細胞瘤-2蛋白; Bax蛋白;細胞凋亡;亞急性濕疹

濕疹，是一種發(fā)生于皮膚的遲發(fā)型變態(tài)反應，臨床上除了表現(xiàn)為紅斑、丘疹、水皰、水腫、脫屑外，還可表現(xiàn)為斑塊、肥厚、苔蘚化［1］。正常皮膚長期保持相對的厚度及彈性，主要依靠皮膚各層細胞增殖與凋亡處于相對平衡狀態(tài)，而中藥外治亞急性濕疹皮損肥厚的首要就在于使皮膚恢復到這種平衡狀態(tài)，但這種作用的分子生物學機制尚不明確，有必要對其進行探討。目前研究表明B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因家族蛋白是在細胞凋亡過程中起重要作用的因子［2］，由此可以設想，甘石青黛膏是否是通過調(diào)節(jié)Bcl-2基因家族蛋白的表達而恢復細胞增殖和凋亡的平衡狀態(tài)。根據(jù)這個設想，本課題組設計實驗，采用免疫組化SP兩步法檢測Bcl-2基因家族中的兩個重要成員Bcl-2與Bax蛋白的表達，探討甘石青黛膏治療濕疹的分子生物學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔SD大鼠40只，4～5周齡，雌雄各半，清潔級，體質(zhì)量(247±27)g，購于北京大學實驗動物中心(合格證號: 11400700019174)。

1.2主要試劑

無水乙醇、二甲苯、蒸餾水、中性樹膠、2%戊巴比妥鈉、2，4-二硝基氯苯丙酮、4%多聚甲醛溶液、磷酸緩沖液(PBS)、檸檬酸溶液、超敏兩步法檢測試劑盒(PV-9001批號: K142716D)、DAB顯色試劑盒(批號: K145213B)，均購自中山金橋生物技術有限公司;兔抗Bcl-2多克隆抗體(批號: ab59348，購自美國abcam公司);兔抗Bax多克隆抗體(批號: 1063-1，購自美國epitomics公司)。

1.3主要儀器

生物顯微鏡(日本Olympus公司);顯微攝像系統(tǒng)(日本Olympus公司);切片機(德國Leitz 1516); Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics);恒溫箱(天津泰斯特儀器有限公司型號: DH4000AB);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司型號: DHP-9052);恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設備廠型號: BS60);低溫冰箱(德國SIMENS型號: KK23E66TI);微波爐(Galanz型號: P70D20TP-C6(WO));移液器(芬蘭Labsystems型號: Y13546-4027);生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司型號: LRH-150);陽離子防脫載玻片、蓋玻片均購自中杉金橋生物技術有限公司;以及濕盒、修復盒、烤片盒、染色架、染色盒等設備。

1.4動物造模

常規(guī)飼養(yǎng)1周后，將40只大鼠作為健康對照組，取下正常皮膚組織制作成石蠟切片備用。具體造模方案參考文獻［3］，造模后大鼠背部皮膚出現(xiàn)斑疹、丘疹、水皰，局部肥厚，甚至呈苔蘚化。隨機分為甘石青黛膏干預組(治療組)20只，造模后無干預組(模型組)20只。

1.5藥物制備

治療藥物:以院內(nèi)制劑甘石青黛膏((98)京衛(wèi)藥制審字第698號，批準文號為:(98)京衛(wèi)藥制字［052］第F-1285號)為基本方，進行劑型改良，藥物優(yōu)化制成新的甘石青黛膏，藥膏含有青黛、煅石膏、爐甘石、滑石等。

1.6藥物干預

造模成功次日，繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)之外，在治療組剃毛區(qū)乙處，治療組予甘石青黛膏外涂干預治療，每次取藥0.6 g(即0.15 g/cm2)，輕輕按摩10圈，以不黏膩為度，每天涂藥2次，療程2周。2周后次日處死大鼠，取背部剃毛區(qū)乙處皮下組織制作成石蠟切片，標記編號備用。

1.7 HE染色

每組每只大鼠選取1張石蠟切片進行HE染色，具體步驟參照文獻［4］，可見健康組大鼠皮膚各層結(jié)構(gòu)正常，棘層均勻，無細胞間水腫及明顯淋巴細胞浸潤，無毛細血管擴張(如圖1);造模后大鼠皮膚組織角化不全、角化過度，棘層增厚，棘細胞內(nèi)水腫，真皮淺層毛細血管輕度擴展及周圍輕度淋巴細胞浸潤(如圖1)。

圖1　大鼠皮膚組織病理(HE染色×400)

1.8皮膚Bcl-2與Bax免疫組化染色

每組每只大鼠選取1張石蠟切片進行免疫組化染色，按照超敏兩步法試劑盒說明書進行操作，一抗分別為兔抗Bcl-2多克隆抗體(濃度1∶50)、兔抗Bax多克隆抗體(濃度1∶50)。

1.9結(jié)果觀察

(1)照相:用Olympus顯微攝像系統(tǒng)在每張切片選擇5個視野進行拍照，所有照片保證在同樣的顯微鏡環(huán)境和拍攝條件下拍攝;(2)圖像分析:用Image-plus pro 6.0圖像分析軟件對每張照片進行分析，計算陽性物質(zhì)表達區(qū)域平均光密度值(OD)，值越高，蛋白表達越強。

1.10統(tǒng)計學分析

2　結(jié)果

2.1 Bcl-2蛋白表達結(jié)果

經(jīng)染色后，Bcl-2蛋白表達位于角質(zhì)形成細胞與淋巴細胞胞漿，呈棕黃色顆粒。在實驗中，健康組Bcl-2蛋白表達呈陽性(如圖2:角質(zhì)形成細胞與淋巴細胞核膜完整，無碎裂，細胞質(zhì)中含有棕黃色顆粒)，模型組Bcl-2蛋白表達呈強陽性(如圖2:可見大量角質(zhì)形成細胞與淋巴細胞，個別碎裂，含有較多棕黃色顆粒)，治療組Bcl-2蛋白表達呈弱陽性(如圖2:角質(zhì)形成細胞與淋巴細胞減少，胞漿中含有的棕黃色顆粒減少)。

每組平均光密度值經(jīng)正態(tài)性檢驗，P值均＞0.05，均符合正態(tài)分布。方差齊性檢驗，P值＞0.05，滿足了方差齊性條件。經(jīng)單因素方差分析F=42.83，P＜0.001，說明至少有兩組平均光密度值是不同的，健康組與模型組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，模型組與治療組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001);健康組與治療組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。Bcl-2蛋白表達統(tǒng)計結(jié)果如表1。

2.2 Bax蛋白表達結(jié)果

經(jīng)染色后，Bax蛋白表達位于角質(zhì)形成細胞與淋巴細胞胞漿與胞膜，呈棕黃色顆粒。在實驗中，健康組Bax蛋白表達呈陽性(如圖3:角質(zhì)形成細胞與淋巴細胞核膜完整，無碎裂，可見細胞中含有棕黃色顆粒);模型組Bax蛋白表達呈弱陽性(如圖3:可見大量角質(zhì)形成細胞與淋巴細胞，個別碎裂，含有的棕黃色顆粒減少);治療組Bax蛋白表達呈陽性(如圖3:角質(zhì)形成細胞與淋巴細胞減少，核膜完整，含有棕黃色顆粒顯著增多)。

每組平均光密度值經(jīng)正態(tài)性檢驗，P值均＞0.05，均符合正態(tài)分布。方差齊性檢驗，P值=0.366 ＞0.05，滿足了方差齊性條件。經(jīng)單因素方差分析F=59.148，P＜0.001，說明至少有兩組平均光密度值是不同的，健康組與模型組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，模型組與治療組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001);健康組與治療組比較無統(tǒng)計學差異(P=0.7＞0.05)。Bax蛋白表達統(tǒng)計結(jié)果如表1。

2.3 Bcl-2/Bax比率結(jié)果

每組Bcl-2/Bax平均光密度值比率經(jīng)正態(tài)性檢驗，P值均＞0.05，均符合正態(tài)分布。方差齊性檢驗，P值=0.215＞0.05，滿足了方差齊性條件。經(jīng)單因素方差分析F= 67.04，P＜0.001，說明至少有兩組平均光密度值比率是不同的。健康組與模型組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，模型組顯著高于健康組;模型組與治療組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，模型組顯著高于治療組;健康組與治療組比較無統(tǒng)計學差異(P=0.451＞0.05)。Bcl-2/Bax比率結(jié)果如表1。

圖2　大鼠皮膚Bcl-2蛋白表達(免疫組化染色×1000)

圖3　大鼠皮膚Bax蛋白表達(免疫組化染色×1000)

表1　三組大鼠皮膚Bcl-2、Bax平均光密度及其比率均值比較(±s)

表1　三組大鼠皮膚Bcl-2、Bax平均光密度及其比率均值比較(±s)

Bcl-2　Bax　Bcl-2/Bax健康組組別0.0474±0.0042　0.0545±0.0093　0.887±0.038模型組　0.093±0.0298　0.0197±0.0086　5.831±0.745治療組0.0216±0.0092　0.0528±0.013　0.438±0.667

3　討論

皮膚要長期保持相對穩(wěn)定的厚度及彈性，主要是皮膚各層細胞增殖與凋亡處于相對平衡狀態(tài)，而濕疹發(fā)病機制中皮膚角質(zhì)形成細胞的增殖、T淋巴細胞的浸潤則將這種平衡狀態(tài)打破［5］。有學者研究認為，Bcl-2基因家族參與了濕疹淋巴細胞和角質(zhì)形成細胞凋亡過程的調(diào)控［6］。Bcl-2基因家族中兩個重要成員Bcl-2和Bax是細胞凋亡調(diào)控系統(tǒng)重要部分，Bcl-2蛋白主要通過穩(wěn)定細胞線粒體膜，抑制細胞凋亡［7］; Bax蛋白是一種胞液蛋白，進入細胞線粒體膜誘導細胞凋亡［8］。Bax蛋白可與Bcl-2蛋白形成異源二聚體或自身形成同源二聚體，當Bax蛋白表達占優(yōu)勢時，細胞對凋亡信號的反應增強，細胞凋亡增多;當Bcl-2蛋白表達占優(yōu)勢時，它與Bax蛋白形成異源二聚體，凋亡被抑制，因此，Bcl-2和Bax的比值可決定細胞的命運［9］。中藥外治濕疹，皮損變薄，直至恢復正常，可能與中藥外治干預治療，促進Bcl-2和Bax細胞調(diào)控系統(tǒng)恢復正常，從而使皮膚表皮細胞的增殖和凋亡恢復平衡有關。

因此，為了進一步驗證上述理論，探究中藥外治濕疹的分子生物學依據(jù)，本課題應用甘石青黛膏干預治療大鼠亞急性濕疹模型，并與健康組、模型組進行對比。在本實驗研究中，健康組Bcl-2/Bax比率接近于1，兩者含量接近，說明此時細胞凋亡調(diào)控系統(tǒng)處于相對平衡狀態(tài)，皮膚細胞進行正常的凋亡;在模型組中，Bcl-2蛋白含量及Bcl-2/Bax比率相比健康組顯著升高，Bax蛋白含量降低，說明此時細胞凋亡處于抑制狀態(tài)，細胞大量增殖，皮損增生肥厚;在甘石青黛膏干預治療組中，Bcl-2蛋白含量與Bcl-2/Bax比率相比模型組顯著降低，Bax蛋白含量升高，Bcl-2/Bax比率及Bax蛋白含量與健康組相比無統(tǒng)計學差異，說明此時細胞凋亡調(diào)控系統(tǒng)正趨于平衡，細胞大量凋亡。

中藥復方甘石青黛膏具有清火熱、散瘀結(jié)、祛風癢的作用，可有效控制斑疹、丘疹、水皰、水腫、肥厚等。通過本實驗研究甘石青黛膏干預大鼠亞急性濕疹模型，對比三組大鼠，運用免疫組化方法檢測大鼠皮膚淋巴細胞和角質(zhì)形成細胞Bcl-2與Bax蛋白的表達。結(jié)果表明甘石青黛膏可有效抑制Bcl-2蛋白表達，促進Bax蛋白表達，使Bcl-2與Bax細胞凋亡調(diào)控系統(tǒng)恢復平衡，二者共同作用調(diào)控細胞凋亡，使皮膚變薄，恢復正常。該實驗結(jié)果表明可能為甘石青黛膏治療濕疹的機制之一。

參考文獻

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(本文編輯:蒲曉田)

Effects on the Bcl-2 and Bax protein expression changes of lymphocytes and keratinocyte cells from subacute eczema lesions in rats intervened by Ganshi Qingdai Cream

JIANG Jing，LI Yuan-wen，ZHANG Feng-chuan，et al.

Dermatology＆STD Department，Dongfang Hospital，Beijing University Of Chinese Medicine，Beijing 100078，China Corresponding author: LI Yuan-wen，E-mail: Yuanwen1581010@163.com

【Abstract】Objective To observe the effects on the Bcl-2 and Bax protein expression changes of lymphocytes and keratinocyte cells from subacute eczema lesions in rats intervened by Ganshi Qingdai Cream，and to explore the molecular biology basis of traditional Chinese medicine external treatment of eczema.Methods Removing the normal skin tissue in rats before modeling，and making them into paraffin sections to use.After the success of modeling all the rats are divided into the treatment group and the model group，the treatment group is used by traditional Chinese medicine Ganshi Qingdai Cream to intervene，the model group is without intervention.Detecting the Bcl-2 and Bax protein expression in three groups of rats.Results The Bcl-2 and Bax protein expression of rats are positive before modeling，and the Bcl-2/Bax ratio closes to 1.In treatment group，the Bcl-2 protein expression is weakly positive，and in model group，the Bcl-2 protein expression is strongly positive，there is statistically significant difference between the two groups(P＜0.001).In treatment group，the Bax protein expression is positive，and in model group，the Baxbook=698,ebook=63protein expression is weakly positive，the two groups compare with statistically significant difference(P＜0.001).There is statistically significant difference of the Bcl-2/Bax ratio between treating group compared with model group(P＜0-001)，which is higher than that of the former.There is not statistically difference of Bcl-2/Bax ratio between treating group compared with healthy group(P＞0.05)Conclusions Ganshi Qingdai Cream can inhibit the Bcl-2 protein expression，promot the Bax protein expression，and make the cell apoptosis regulation system tend to balance.

【Key words】Ganshi Qingdai Cream;B-cell lymphoma-2;Bax protein;Cell apoptosis; Subacute eczema

(收稿日期:2014-10-27)

通訊作者:李元文(1962－)，本科，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，中國性學會中醫(yī)性學專業(yè)委員會主任委員，北京中醫(yī)藥學會皮膚性病專業(yè)委員會副主任委員。研究方向:中醫(yī)皮膚性病學。E-mail: Yuanwen1581010@163.com

作者簡介:蔣靜(1988－)，2008級七年制在讀碩士研究生。研究方向:慢性皮膚病與性病。E-mail: 827742699@ qq.com

基金項目:北京市科技計劃“十病十藥”研發(fā)項目(Z131100002513013);科技促進中醫(yī)藥特色優(yōu)勢學科振興發(fā)展主題計劃(YNZJ2011-02)

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2015.06.014

作者單位: 100078北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院皮膚與性病科［蔣靜(碩士研究生)、李元文、張豐川、蔡玲玲、聶晶(碩士研究生)、李天嬌(碩士研究生)、張力元(碩士研究生)、陳雪燕(碩士研究生)］;北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院(李根茂、葛東宇)