王慶琴　焦保權　蘇鐸　郝明吳小華

作者單位: 050081石家莊市，中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院婦產科

孕婦外周血游離胎兒DNA用于無創(chuàng)產前檢測的研究進展

王慶琴焦保權蘇鐸郝明吳小華

作者單位: 050081石家莊市，中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院婦產科

【關鍵詞】無創(chuàng)產前檢測;外周血游離胎兒DNA;大規(guī)模平行測序

產前檢查的主要目的對出生之前胎兒的染色體及基因的異常進行確診，對家庭的優(yōu)生優(yōu)育以及預防控制新生兒發(fā)病都有十分重要的臨床意義。傳統(tǒng)的侵入性產前檢查，包括:羊膜穿刺、絨毛取樣(chorionic villous sampling，CVS)和臍帶血穿刺，都可能對胎兒及孕婦產生一定的危害，并存在0.5%～1%流產的風險。利用微創(chuàng)或非創(chuàng)傷性的方法檢測胎兒遺傳性狀的方法一直是科研及臨所求追的目標，孕婦外周血游離胎兒DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)的發(fā)現則為無創(chuàng)產前檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)技術提供了一個全新的策略，并且在臨床上得到廣泛的應用。特別是近年來快速發(fā)展的大規(guī)模平行測序(massively parallel sequencing，MPS)技術，更加提高了檢測的靈敏度和特異性，使得外周血cffDNA應用于胎兒性別、血型、單基因病、染色體相關疾病的檢測方面，都得到了長足的發(fā)展。本文將對孕婦外周血cffDNA作簡要介紹及近年來在臨床的應用作一綜述。

1　什么是cffDNA

1.1CffDNA的性質游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)是可以自由循環(huán)于孕婦外周血，由小片段的細胞外DNA組成的遺傳物質。cfDNA的主要來源于母體血細胞的破裂，而來自胎兒的DNA(cffDNA)平均只占10%。研究發(fā)現，通過cffDNA碎片可以整合胎兒全部基因組，其半衰期只有16 min，可以分娩2 h后迅速的消除，提示cffDNA具有一定的特異性，由此可見對cfDNA的分析在產前檢測方面具有重要的意義。研究發(fā)現，當胎兒遺傳物質比例(fetal fraction，ff)小于4%時，研究結果缺乏一定的可信性［1］。但ff隨著孕周的增加而升高，研究表明，cffDNA最早可在孕齡4周時被檢測到，懷孕約7周的孕婦外周血ff已達到檢測的濃度要求［1］。但為了檢測的準確性，檢測時間一般選擇孕中期以后。

1.2CffDNA的大小通過二代測序對cfDNA檢測發(fā)現［2］，cfDNA片段大多在160 bp左右，只有極少數能達到340 bp，而Y染色體相關序列則一般小于150 bp由此提示cffDNA多數都小于母源性的cfDNA。正因如此，在設計NIPT實驗時，需要將目的片段長度加以考慮，例如檢測單基因突變型疾病時，設置較小的擴增子(小于150 bp)則足以完成對目的突變檢測。但是某些疾病，并不是因為單基因的突變或者短序列的變化所導致，而是因為相鄰三個核苷酸的重復導致基因功能的喪失，例如脆性X綜合征(fragile X syndrome) 因(CGG) n的重復導致其功能基因FMR1長度可以達到1 kb。另外對亨廷頓舞蹈癥(huntington disease HD)雖有成功診斷報道，但只有三聯核苷酸(CAG) 在HTT基因外顯子1區(qū)時，才成功被檢測。Fan等［2研究發(fā)現，亨廷頓病(huntington disease，HD)患者的三聯體重復都大于40，但由于cffDNA片段大小的原因只有重復數值在40～60才能被檢測，而大于60時NIPT則顯得有些乏力。

2　CffDNA的來源

2.1體內試驗證明cffDNA來源于胎盤許多年來對cffDNA的來源，科學家們一直持有不同的意見，而目前被大多數接受的觀點是，cffDNA主要來自于胎盤上一些特定細胞的核小體。研究表明，這些核小體是來自胎盤滋養(yǎng)層細胞凋亡所裂解的物質，并且孕期cffDNA的濃度一定程度上代表了滋養(yǎng)層的健康狀態(tài)從細胞層面來說，胎盤是一個動態(tài)器官，在滋養(yǎng)層細胞的增殖分化過程中，發(fā)生著持續(xù)動態(tài)的細胞更替，并將凋亡的細胞物質排到母體，但此過程并不會引起炎癥反應。Bischoff等［3］將從母體血漿中分離出的凋亡物質進行分類，并通過電子顯微鏡發(fā)現這些凋亡物質中存在核小體和染色質。有研究［3］發(fā)現，通過氧應激試驗，將足月的胎盤組織培養(yǎng)在不同的氧分壓濃度下(正常組10%和缺氧組0.5%)，20 h培養(yǎng)以后發(fā)現游離β-球蛋白DNA(cell-free β-globin DNA)的濃度在缺氧組中有了顯著的提高。Gupta等［4］的一項研究同樣證明了cffDNA的胚胎來源，他們直接從胎盤組織中分離得到合體滋養(yǎng)層微粒子(syncytiotrophoblast microparticles，SMs)，而SMs是合體滋養(yǎng)層融合過程中釋放的產物，并且在SMs和培養(yǎng)上清中都能檢測到胎兒的DNA。而臨床中也發(fā)現，在母體血漿和血清中，cffDNA不管是作為游離分子還是存在于微粒的載體中，都成功被檢測到。

2.2cffDNA來源于胎盤除了假性妊娠或胎盤血液循環(huán)未建立之外，只有當胚胎存在時才能檢測到cffDNA。當存在病理性妊娠時，由于炎性反應會加速胎盤細胞的凋亡，進而導致母體血漿中cffDNA的濃度相對升高。在正常妊娠時，cffDNA會在分娩后迅速的消除，治療性流產手術后，如果胎盤分離不完全，母體血漿中也同樣會檢測到cffDNA的存在。有些妊娠期胎盤組織存在不完全胚胎嵌合性(confined placental mosaicism，CPM)，使得胎盤組織與胎兒有著不同的基因型。Faas等［5］研究的1例妊娠中發(fā)現，通過cffDNA分析提示胎兒核型為45X，對滋養(yǎng)層細胞分析的核型同樣為45X，但間充質核心組織的核型卻是46XX，該現象充分證明了cffDNA的胎盤來源。有研究［5］報道，與對照組相比，進行CVS手術孕婦血漿的cffDNA濃度并沒有顯著性變化，而對雙胞胎輸血(twin-to-twin transfusion)癥狀的胎兒進行激光消融手術后，cffDNA的濃度會有明顯的升高，該結果也同樣印證了cffDNA來源于胎盤的事實。

2.3CffDNA主要來源于凋亡細胞而非胎盤本體

2005年，Wataganara等［6］研究母體cffDNA的濃度是否受到胎盤體積的影響，并將測量懷有男胎母體血漿中Y染色體特異基因確定cffDNA濃度并與模型比較發(fā)現，胎盤體積不會引起cffDNA濃度的變化，研究同樣提示說明了胎兒DNA的釋放是一種受到控制的過程，且此過程與胎盤大小無關。進而可以推測細胞凋亡似乎是胎兒DNA從胎盤進入母體的主要控制因素。研究發(fā)現，合體滋養(yǎng)層的炎性反應和胎盤的氧化作用也同樣加速了細胞凋亡，進而導致cffDNA的釋放。Hahn等［7］認為胎兒DNA的釋放，為細胞凋亡和壞疽共同所致，實驗證明細胞凋亡的細胞信號轉導通路會進而引起合體滋養(yǎng)層組織的壞疽，而此過程直接導致cffDNA最終釋放到母體。綜上所述，結合體內和體外實驗可以充分的證明cffDNA來源于胎盤組織，并且cffDNA母體外周血濃度對胎盤的健康狀況有著良好的指導意義。

3　CffDNA的臨床應用

3.1胎兒性別鑒定NIPT首次應用于臨床是進行胎兒性別檢測，傳統(tǒng)檢測方法(如絨毛膜取樣、羊水穿刺、超聲)可以準確檢測胎兒性別要求孕齡至少在1周以后，而利用外周血胎兒DNA進行檢測可以減少到7周［8］，因此利用cffDNA進行胎兒性別對預防和控制性連鎖疾病有重要的意義。對于X連鎖隱形遺傳病(如血友病、杜氏肌營養(yǎng)不良)，如果母親為攜帶者，則男胎有50%的概率患有該疾病，而對于經由cffDN確定懷有女胎的孕婦，可以免去傳統(tǒng)有創(chuàng)檢查確定性別的風險，且更早的作出診斷［9］。對于先天性腎上腺皮質增生(congenital adrenal hyperplasia，CAH)高風險妊娠的孕婦，產前的地塞米松治療可以有效減輕女胎的生理畸形，而對于懷有男胎的孕婦，則無需過多治療，因此通過cffDNA早期進行性別檢測可以有效的消除孕婦的過度治療。

最初NIPT技術檢測胎兒性別是通過是否發(fā)現染色體特異性基因DSY14和SRY，但此方法只有在懷有男胎時才能被檢測，而并非所有的孕婦的cffDNA濃度都能達到檢測閾值，且其靈敏度只有80% 90%［9］。近年來隨著QPCR和MPS技術應用，孕前期性別檢測的準確度提升到97%～100%［10］。盡管在美國作為父母有權了解胎兒特征信息，并提供非醫(yī)療目的的性別選擇，但國內由于傳統(tǒng)觀念及社會倫理因素胎兒的性別信息仍需要進行嚴格的控制。

3.2胎兒血型測定當RhD陰性母親懷有RhD陽性血的胎兒時，孕婦外周血會有一定風險產生RhD抗體并在母體內長期保留，進而導致者胎兒或新生兒的溶血相關性疾病(haemolytic disease of the fetus and new born，HDFN)。因為RhD陰性的母親不含有RhD基因，通過檢測外周血中是否存在RhD基因，從而判斷胎兒是否為RhD陽性。許多國家將此項技術都作為患有高危險HDFN孕婦的常規(guī)檢測，當胎兒基因型為RhD陰性時，進行標準的產前保健，而當RhD陽性時則需進行早期的檢測以防止宮內溶血和早期流產的發(fā)生。NIPT檢測RHD血型的常規(guī)應用表現出極高的準確性，并且對產前預防性抗-D抗體的使用有著重要的臨床指導意義，并且越是早期的檢測，則越有利于減少對孕婦身體和心理的傷害。研究表明，利用MPS技術可以準確的鑒別孕齡11周胎兒的RHD血型［10］Clausen等［11］最近的一篇綜述提示，通過NIPT胎兒血型的基因分型，其靈敏度和特異性都能達到99%以上;近幾年的大規(guī)模臨床研究也同樣證實了其準確性［12］。由于在無創(chuàng)和準確方面的優(yōu)越性，此技術在臨床上檢測RhD血型已得到廣泛應用。

3.3單基因病診斷類似胎兒性別鑒定和胎兒血型測定的原理，通過檢測孕婦外周血的疾病相關基因序列來確定胎兒是否遺傳來自父親相關疾病的等位基因，或者是否發(fā)生額外的基因突變。通過檢測和排除此類基因序列可幫助確定診斷和排除相關的單基因病，也可用來確定胎兒HLA分型。但是此項技術在臨床的應用進展并不快，主要因為存在個體遺傳病風險的家庭相對較少，并且對于此類疾病的診斷需要針對性的個體化實驗。

目前單基因在新生兒中的發(fā)病率約為3‰，而其檢測的金標準仍為介入性的有創(chuàng)診斷。應用于臨床的NIPT單基因病方案的限制條件是母親不能攜帶有致病基因，主要通過PCR技術對相應位點進行特異擴增，檢測擴增片段的長度、熒光值或者通過直接測序的技術比對突變點和野生型序列的區(qū)別，進而檢測單個堿基的替換、缺失和插入。常見單基因病如肌強直性營養(yǎng)不良、軟骨發(fā)育不全、亨廷頓病、地中海貧血、先天性腎上腺增生、囊性纖維化病都能夠成功被檢測。Papasavva等［13］通過49個在β球蛋白基因上的高雜合單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點，檢測101例可能患有父源性β-地中海貧血的胎兒，結果提示此方法對該疾病診斷有良好的靈敏度和特異性。

隨著技術的發(fā)展，數字PCR和MPS技術的產生使得通過外周血檢測胎兒母源性的單基因病成為可能。此兩項技術原理是通過檢測等位基因的突變型和正常型在外周血中的比例，進而確定胎兒是否攜帶致病基因。如果胎兒攜帶致病基因，則相對突變劑量會增加。大量臨床研究提示此類技術可準確的診斷染色體隱形遺傳?。?4］。Tsui等［15］通過檢測12例孕齡11周孕婦的外周血樣本，成功檢測出血友病高風險胎兒的基因型，為X染色體隱性遺傳病的非侵入性產前診斷提供了藍本。Lo等［16］利用外周血中游離DNA進行全基因組測序，整合出完整的孕婦和胎兒的基因組序列，并構基因組遺傳圖譜，此方法為無創(chuàng)產前基因診斷提供了一個新的方案，具有重大意義。

3.4非整倍體染色體病由于配子在減數分裂期間染色體分配發(fā)生異常，導致同源染色體發(fā)生數目上的改變，進而配子結合產生非整倍體合子。研究發(fā)現，平均每300個新生兒中就會有1個存在染色體病，并且染色體病導致流產的比例可達到35%［17］。但患有染色體病的胎兒仍有一部分能夠成功分娩，并帶有嚴重的生理缺陷，如21三體綜合征(21-trisomy syndrome， T21)。早期的研究發(fā)現在懷有T21胎兒的孕婦血漿cffDNA的比例較正常組高。而近年來由于胚胎特異性標志物和檢測技術的不斷完善，并結合技術之間的相互運用，非整倍體染色體病的診斷取得不斷的發(fā)展Papageorgiou等［18］通胎兒特異性甲基化與QPCR技術相結合的方法，成功在40例樣本中檢測到14例21三體綜合征患兒，靈敏度和特異性都達到100%。

大規(guī)模基因組測序技術不僅推動了單基因病診斷的進步，同樣使得非整倍體的診斷取得快速的發(fā)展，原理是通過孕婦外周血cfDNA擴增測序，讀取大量的數據進行分析整合以達到對母體和胎兒每條染色體足夠的覆蓋度，并將每條染色體的比例與正常組進行比較從而對非整倍體病進行診斷。近年來大規(guī)模臨床樣本研究驗證了MPS技術在無創(chuàng)診斷染色體病的優(yōu)勢，包括對13、18、21號染色體三倍體(T13、T18、T21)的檢查，有著極高的準確性，并成為最有可能替代傳統(tǒng)有創(chuàng)檢查的新興檢查方法［19，20］。作為最小的常染色體，2號染色體在MPS中往往得到的數據量相對較少，而定向測序(targeted sequencing)的技術則很好的解決了這個問題。通過限制DNA區(qū)域，定向測序可以大大提高目的區(qū)域的覆蓋度，減少無效數據產生，大大提高檢測效率。Sparks等［21］通過定向測序的方法，成功從29個樣本中診斷出39例21-三倍和7例18-三體，靈敏度和特異性都為100%，而讀取的數據量只有非定向測序的5%。近年來又產生了基于SNP的定向測序(SNP-based targeted sequencing，S-Ts)技術同樣非常高效。研究發(fā)現，此方法的一個重要優(yōu)勢在于高效檢測T13、T18、T21的同時，性染色體核型異常也可同時被檢測(例如X0，XXY，XXX，XYY)［22］。雖然定向測序的數據量不能對所有染色體達到足夠的覆蓋度，但能夠在低通量測序儀同樣進行非整倍體診斷，使得此項技術在一些中等規(guī)模的臨床檢測中心更受到歡迎。由于雙胞或多胎的母體外周血中cffDNA的濃度確定和區(qū)分等困難因素，使無創(chuàng)技術對雙(多)胎的檢測較少。Grmminger等［23］對16例雙胞胎樣本進行檢測，1例整倍體和4例21三體都準確檢測，而并未出現假陽性和假陰性結果。據文獻報道只有Grmminger等［23［24］分別對2例三胞胎樣本進行了檢測，但新生兒表型全部正常。雖然NIPT對單胎的染色體的數目異常診斷技術較為成熟，由于多種不可控因素，使得NIPT對雙(多)胎的檢測的準確性仍需大量的臨床樣本進行佐證。

3.5染色體片段異常診斷對于不平衡易位，理論上NIPT的檢測結果應該是部分的染色體三體和單體在一項回顧性分析中，對已經確定的6例胎兒不平衡的孕婦外周血游離DNA進行檢測，Srinivasan等［25］通過深度測序的方法全部成功識別，其中2例樣本傳統(tǒng)核型分析不能說明易位來源，而測序的方法則很容易解決，可以說明NIPT技術相對于傳統(tǒng)核型分析更有優(yōu)越性。但進行更小的易位則需要更加大量的測序數據和更高的數據分析能力。例如S-Ts技術，則需要足夠多且有效的SNP才能完成對目標區(qū)域的準確檢測。

而對拷貝數的變化，如核苷酸重復和缺失，通過NIPT技術也有成功的報道，例如在1例12號染色體的4-Mb的缺失［26］和2例22號染色體的3-Mb的缺失［27］都準確的被檢測。Srinivasan等［25］對11例孕婦血漿cffDNA樣本進行檢測，發(fā)現其中8例樣本的染色體拷貝異常，并通過流產組織的核心分析得到驗證。因此，NIPT檢測核酸拷貝數變化的臨床應用，仍需要技術檢測手段的創(chuàng)新。

孕婦外周血cffDNA的發(fā)現為NIPT提供了一個全新的方向，臨床上檢測胎兒性別、血型，cffDNA都發(fā)揮了重要的作用。盡管cffDNA在檢測單基因病和染色體病是有一定的局限性，但隨著技術檢測方法的進步，相信此項技術可能會逐步添補或取代現有的檢測方法。當前NIPT的臨床應用雖然有限，但NIPT有著無創(chuàng)、廣泛、早期等傳統(tǒng)檢測所不具有的特點，并可大大減低孕婦的痛苦，使得NIPT在臨床方面有良好的應用前景。

參考文獻

1Norton ME，Brar H，Weiss J，et al.Non-Invasive chromosomal evaluation (NICE) study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18.Am J Obstet Gynecol，2012，207: 137 e131-138.

2Fan HC，Blumenfeld YJ，Chitkara U，et al.Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell-free DNA by paired-end sequencing.Clin Chem，2010，56: 1279-1286.

3Bischoff FZ，Lewis DE，Simpson JL.Cell-free fetal DNA in maternal blood: kinetics，source and structure.Hum Reprod Update，2005，11: 59-67.

4Gupta AK，Holzgreve W，Huppertz B，et al.Detection of fetal DNA and RNA in placenta-derived syncytiotrophoblast microparticles generated in vitro.Clin Chem，2004，50: 2187-2190.

5Faas BH，de Ligt J，Janssen I，et al.Non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using massively parallel sequencing-by-ligation and evidence that cell-free fetal DNA in the maternal plasma originates from cytotrophoblastic cells.Expert Opin Biol Ther，2012，12(Suppl 1) : S19-26.

6Wataganara T，Metzenbauer M，Peter I，et al.Placental volume，as measured by 3-dimensional sonography and levels of maternal plasma cell-free fetal DNA.Am J Obstet Gynecol，2005，193: 496-500.

7Hahn S，Huppertz B，Holzgreve W.Fetal cells and cell free fetal nucleic acids in maternal blood: new tools to study abnormal placentation? Placenta，2005，26: 515-526.

8Devaney SA，Palomaki GE，Scott JA，et al.Noninvasive fetal sex determination using cell-free fetal DNA: a systematic review and meta-analysis.JAMA，2011，306: 627-636.

9Rodriguez de Alba M，Bustamante-Aragones A，Perlado S，et al.Noninva sive prenatal diagnosis of monogenic disorders.Expert Opin Biol Ther 2012，12(Suppl 1) : S171-179.

10Aghanoori MR，Vafaei H，Kavoshi H，et al.Sex determination using fre fetal DNA at early gestational ages: a comparison between a modifie mini-STR genotyping method and real-time PCR.Am J Obstet Gynecol 2012，207: 202 e201-208.

11Clausen FB.Integration of noninvasive prenatal prediction of fetal bloo group into clinical prenatal care.Prenat Diagn，2014，34: 409-415.

12Macher HC，Noguerol P，Medrano-Campillo P，et al.Standardizatio non-invasive fetal RHD and SRY determination into clinical routine u sing a new multiplex RT-PCR assay for fetal cell-free DNA in pregnan women plasma: results in clinical benefits and cost saving.Clin Chi Acta，2012，413: 490-494.

13Papasavva TE，Lederer CW，Traeger-Synodinos J，et al.A minimal set SNPs for the noninvasive prenatal diagnosis of beta-thalassaemia.An Hum Genet，2013，77: 115-124.

14Lun FM，Tsui NB，Chan KC，et al.Noninvasive prenatal diagnosis monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosag on DNA in maternal plasma.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105 19920-19925.

15Tsui NB，Kadir RA，Chan KC，et al.Noninvasive prenatal diagnosis hemophilia by microfluidics digital PCR analysis of maternal plasm DNA.Blood，2011，117: 3684-3691.

16Lo YM，Chan KC，Sun H，et al.Maternal plasma DNA sequencing re veals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus.S Transl Med，2010，2: 61ra91.

17Hassold T，Abruzzo M，Adkins K，et al.Human aneuploidy: incidence origin，and etiology.Environ Mol Mutagen，1996，28: 167-175.

18Papageorgiou EA，Karagrigoriou A，Tsaliki E，et al.Fetal-specific DN methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21 Nat Med，2011，17: 510-513.

19Chiu RW，Akolekar R，Zheng YW，et al.Non-invasive prenatal assess ment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing large scale validity study.BMJ，2011，342: c7401.

20Sehnert AJ，Rhees B，Comstock D，et al.Optimal detection of fetal chro mosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cel free fetal DNA from maternal blood.Clin Chem，2011，57: 1042-1049.

21Sparks AB，Wang ET，Struble CA，et al.Selective analysis of cell-fre DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy.Prenat Diagn 2012，32: 3-9.

22Sparks AB，Struble CA，Wang ET，et al.Noninvasive prenatal detectio and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: e valuation for trisomy 21 and trisomy 18.Am J Obstet Gynecol，2012 206: 319 e311-319.

23Grmminger S，Yagmur E，Erkan S，et al.Fetal Aneuploidy Detection b Cell-Free DNA Sequencing for Multiple Pregnancies and Quality Issue with Vanishing Twins.Journal of Clinical Medicine，2014，3: 679-692.

24Canick JA，Kloza EM，Lambert-Messerlian GM，et al.DNA sequencin of maternal plasma to identify Down syndrome and other trisomies i multiple gestations.Prenat Diagn，2012，32: 730-734.

25Srinivasan A，Bianchi DW，Huang H，et al.Noninvasive detection of fe tal subchromosome abnormalities via deep sequencing of maternal plas ma.Am J Hum Genet，2013，92: 167-176.

26Peters D，Chu T，Yatsenko SA，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal microdeletion syndrome.N Engl J Med，2011，365: 1847-1848.

27Jensen TJ，Dzakula Z，Deciu C，et al.Detection of microdeletion 22q11 2 in a fetus by next-generation sequencing of maternal plasma.Cli Chem，2012，58: 1148-1151.

(收稿日期:2014－11－25

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.042

【文章編號】1002－7386(2015) 09－1394－04

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 714.5