金 強，姚曉玲，楊曉雙

鮑曼不動桿菌在自然界分布廣泛，且具有耐干燥、不易被消毒劑滅活等特點，因此成為臨床常見及醫(yī)院感染的條件致病菌，近年來已取代銅綠假單胞菌躍居臨床非發(fā)酵菌分離率的首位，僅此于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌位居我國臨床常見革蘭陰性桿菌分離率的第3 位［1］。與此同時，隨著臨床上抗生素的大量使用，強大的選擇性壓力使鮑曼不動桿菌的多重耐藥性日趨嚴重，耐碳氫酶烯類的鮑曼不動桿菌世界各地已均有報道。我院近年來臨床標本中鮑曼不動桿菌的分離率持續(xù)上升，且多重耐藥株逐年增多，已引起臨床高度重視，本文收集我院2014年1月－2014年12月臨床分離的48 株耐碳氫酶烯類鮑曼不動桿菌進行耐藥性和基因同源性分析，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株來源:48 株耐碳氫酶烯類鮑曼不動桿菌均分離自我院2014年1月至2014年12月臨床送檢標本(剔除同一患者重復(fù)分離菌株)，其中來自痰標本37 株，分泌物6株，尿液2 株，血液、腦脊液和靜脈導(dǎo)管各1 株。所有菌株的分離培養(yǎng)嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第3 版)進行，鑒定采用法國生物梅里埃公司的ATB Expression 半自動微生物系統(tǒng)鑒定到種。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 采用紙片擴散(K－B)法進行藥敏試驗，按《臨床檢驗操作規(guī)程》(第3 版)操作，結(jié)果按照CLSI 2014年標準判斷。藥敏紙片:哌拉西林、替卡西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南、復(fù)方新諾明、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星為英國Oxoid 公司產(chǎn)品。MH 培養(yǎng)基為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。藥敏資料用WHONET5.4 軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 基因同源性分析 采用腸桿菌科間一致重復(fù)序列PCR(ERIC-PCR)方法，參照文獻［2］設(shè)計引物1:5＇-ATGTAAGCTCCTGGGG ATTCAC-3＇;引物2:5 ＇-AAGTA AGTGACTGGGGTGAGCG-3＇，引物和PCR 擴增試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司。挑取平皿上孵育過夜的純培養(yǎng)菌落，加入滅菌蒸餾水50 μL 中，95℃水浴15 min，冰浴5min 冷卻，12000 r/min 離心5 min，取上清液－20℃保存?zhèn)溆?。總反?yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35 次，最后72℃延伸10 min。取10 μL/孔PCR 產(chǎn)物在含溴乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳90 min，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，條帶數(shù)目位置完全相同，判為同一克隆株;主條帶位置相同，副帶相差1～2 條者為基因型相似或密切相關(guān);不滿足上述條件者為不同的基因型。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果 48 株耐碳氫酶烯類鮑曼不動桿菌不僅對臨床常用的碳氫酶烯類藥物亞胺培南和美羅培南耐藥，而且對大部分的β－內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類和磺胺類抗生素均有較高耐藥率(＞93.75%)，僅對頭孢哌酮/舒巴坦敏感性高(＜45.83%)。見表1。

表1 48 株耐碳氫酶烯類鮑曼不動桿菌對常見14 種抗菌藥物的耐藥性(%)

2.2 基因同源性分析 ERIC-PCR 基因分型結(jié)果顯示48 株耐碳氫酶烯類鮑曼不動桿菌可分為3 個基因型，分別命名為A 型、B 型和C 型。數(shù)量分布為A 型2 株，B 型43 株和C 型3株，其中B 型為流行株。

2.3 菌株基因型的科室分布 48 株鮑曼不動桿菌分離自重癥監(jiān)護病房26 株，呼吸科4 株，神經(jīng)外科3 株，骨科3 株，燒傷科3 株，急內(nèi)、內(nèi)干、血液、普外科各2 株，兒科1 株。具體的基因型分布見表2。

表2 48 株鮑曼不動桿菌ERIC－PCR 基因分型結(jié)果及分布

3 討論

多重耐藥/泛耐藥鮑曼不動桿菌的出現(xiàn)，給醫(yī)院感染控制及臨床治療帶來了極大的困難，被學(xué)者視為21世紀革蘭陰性菌中的“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌”，也是目前我國最重要的“超級細菌”。尤其是隨著近年來碳青酶烯類抗菌藥物在臨床上的廣泛使用，直接導(dǎo)致鮑曼不動桿菌對碳青酶烯類藥物的敏感性下降，并出現(xiàn)了耐藥菌株。自1991年美國紐約首次出現(xiàn)耐碳青酶烯類不動桿菌的暴發(fā)流行以來，全球各地包括我國香港地區(qū)均有耐碳青酶烯類鮑曼不動桿菌報道。近年來其嚴重的耐藥情況已成為普遍關(guān)注的問題［3］，臨床常常面臨無藥可用的局面，由于細菌的耐藥性和耐藥機制存在明顯的地區(qū)和醫(yī)院差異，臨床醫(yī)生尤應(yīng)了解當?shù)靥貏e是所在醫(yī)院的監(jiān)測結(jié)果，故此對耐碳青酶烯類鮑曼不動桿菌進行分子流行病學(xué)研究十分重要。

耐藥性監(jiān)測是傳統(tǒng)流行病學(xué)研究的方法，但影響因素較多，鑒別力低，在醫(yī)院感染檢測與預(yù)防控制中的應(yīng)用有限，而分子流行病學(xué)研究中的基因分型技術(shù)能檢測出不同來源具有相近親緣關(guān)系的菌株，鑒別力更高，能為耐藥鮑曼不動桿菌的院感監(jiān)測和治療提供可靠的依據(jù)。目前，基因分型的方法主要有脈沖場凝膠電脈(PFGE)、隨機擴增DNA 多態(tài)性(RAPD)以及質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶譜分型等［4］。PFGE 法儀器昂貴，操作復(fù)雜、費時，難以在基層實驗室開展，RAPD 使用的是隨機引物，重復(fù)性較差，存在一定的局限性，而腸桿菌科基因間保守重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(ERIC-PCR)作為一種長引物隨機PCR 分子生物學(xué)技術(shù)，具有操作簡便、重復(fù)性好、引物適用范圍廣、擴增條件容易掌握，擴增條帶不復(fù)雜、重復(fù)性好，分辨能力與PFGE 非常接近等特點，適合于大批量標本的流行病學(xué)調(diào)查，在細菌的分子流行病學(xué)研究方面應(yīng)用很廣［5-7］。本研究顯示，48 株耐碳青酶烯類鮑曼不動桿菌均為多重耐藥株，除對頭孢哌酮/舒巴坦保持一定的敏感性之外，對其他臨床常用的多種抗生素具有嚴重的耐藥性，與文獻報道相符［8］。我們采用ERIC-PCR 對48 株耐碳青酶烯類鮑曼不動桿菌進行同源性分析發(fā)現(xiàn)，48 株菌株分別來自3 種不同分型的克隆株，B型克隆株是主要的流行株，B 型克隆菌株中分離自ICU25 株、呼吸科3 株、神經(jīng)外科3 株和骨科3 株。調(diào)閱病史顯示，神經(jīng)外科和骨科所檢出6 株菌株的患者曾在ICU 住院治療，說明科室間存在交叉感染，這種克隆傳播也可能是導(dǎo)致耐藥菌株不斷增加的重要原因之一。依據(jù)本研究的結(jié)果，結(jié)合文獻報道［9-10］，我們不難發(fā)現(xiàn)，同一克隆菌株在不同個體及科室間的相互傳播可能是醫(yī)院內(nèi)泛耐/全耐鮑曼不動桿菌感染原因之一。因此，加強抗菌藥物臨床管理，嚴格遵守?zé)o菌操作和感染控制規(guī)范，重視醫(yī)護人員手衛(wèi)生，加強消毒隔離措施才是控制耐碳青酶烯類鮑曼不動桿菌醫(yī)院感染的重要手段。我們有理由相信，分子流行病學(xué)手段將在耐碳青酶烯類鮑曼不動桿菌的醫(yī)院感染預(yù)防控制方面起到越來越重要的作用［11］。

［1］ZHU Demei，WANG Fu，HU Fupin，et al.CHINET 2010 surveillance of bacterial resistance in China［J］.Chinese Journal of Infection and Chemotherapy，2011，11(5):321-329.

［2］魯懷偉，戴媛媛，馬筱玲.ICU 多藥耐藥鮑氏不動桿菌感染暴發(fā)分子流行病學(xué)與碳青酶烯耐藥基因分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20(18):2732-2734.

［3］姚曉玲，鄭 嵐，李伯惠.鮑曼不動桿菌的臨床分布與耐藥性分析［J］.淮海醫(yī)藥，2012，30(1):12-13.

［4］宋 娟，華 川.鮑曼不動桿菌分子流行病學(xué)的基因分型技術(shù)及應(yīng)用［J］.臨床檢驗雜志，2011，29(4):290-291.

［5］鐘 敏，黃文芳，劉 華，等.多重耐藥鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶耐藥基因和同源性分析［J］.臨床檢驗雜志，2012，30(5):367-370.

［6］王鳳平，陳 清，吳奎海，等.臨床分離大腸埃希菌耐藥機制和基因分型研究［J］.中國實驗診斷學(xué)，2011，15(2):293-297.

［7］張鳳華，王 晶，陳 潔，等.應(yīng)用腸桿菌科基因間重復(fù)序列分析多重耐藥銅綠假單胞菌基因指紋圖譜［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22(6):539-541.

［8］周東升，林 榮，沈志君，等.耐碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌分子流行病學(xué)研究［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15(2):181-183.

［9］陳軼堅，胡付品，黃海輝，等.耐碳青霉烯酶類抗生素不動桿菌屬的同源性分析［J］.中國感染與化療雜志，2012，12(4):110-112.

［10］Garnacho-Montero J，Amaya-Villar R.Multiresistant Acinetobacter baumannii infections:epidemiology and management［J］.Curr Opin Infect Dis，2010，23(4):332-339.

［11］劉文靜，徐英春.鮑氏不動桿菌流行病學(xué)特點及分型技術(shù)［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20(19):3078-3080.