陳 亮，鄭宇宏，范旭紅，孟凡凡，孫星邈，張?jiān)品?，王明亮，王曙?/p>

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所/大豆國(guó)家工程研究中心，長(zhǎng)春 130033）

品種鑒定是種子生產(chǎn)中的重要步驟，也是保護(hù)新品種、防止假冒偽劣品種進(jìn)入市場(chǎng)、維護(hù)農(nóng)民利益的重要手段。生產(chǎn)實(shí)踐中由于忽視品種真實(shí)性的鑒定，往往給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)無(wú)可挽回的損失，因此品種鑒定顯得尤其重要[1-2]。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法主要依據(jù)種子、幼苗和植株形態(tài)特征、農(nóng)藝性狀的差異，將不同品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。這種方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，但由于許多形態(tài)學(xué)性狀鑒定周期較長(zhǎng)、易受環(huán)境影響，因此有時(shí)很難對(duì)品種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[3]。近年來(lái)，隨著優(yōu)異親本的重復(fù)利用以及新種質(zhì)的匱乏，部分大豆品種出現(xiàn)血緣關(guān)系相近、表型特征相似的情況，造成傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法越來(lái)越不適應(yīng)品種鑒定工作[4]。隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)、同工酶電泳圖譜相繼被用于品種鑒定[5]。這些方法依據(jù)品種蛋白質(zhì)、同工酶等生化特性方面的差異，可將不同品種準(zhǔn)確地區(qū)分開(kāi)，具有速度快、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。但也存在一些問(wèn)題，蛋白電泳技術(shù)對(duì)親緣關(guān)系較近的品種難以鑒別，同工酶在不同組織或器官中的分布與活性差異較大，因而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、同工酶電泳圖譜在生產(chǎn)實(shí)踐中無(wú)法得到大規(guī)模地推廣應(yīng)用[6-7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記指紋圖譜直接反應(yīng)DNA水平上的差異，成為當(dāng)今有效、快捷的品種鑒定技術(shù)[8]。分子標(biāo)記指紋圖譜技術(shù)主要有限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）等。其中的SSR標(biāo)記，與其他分子標(biāo)記相比，具有周期短、易操作、穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、真實(shí)可靠等優(yōu)點(diǎn)[9]。目前，在大豆品種的真?zhèn)舞b定、遺傳關(guān)系分析和解決品種產(chǎn)權(quán)糾紛等方面，SSR指紋圖譜技術(shù)所起到的支持作用受到越來(lái)越多地關(guān)注。文中綜述了SSR指紋圖譜身份證技術(shù)在大豆品種鑒定方面的應(yīng)用進(jìn)展；綜合分析了當(dāng)前SSR指紋圖譜身份證構(gòu)建技術(shù)存在的問(wèn)題，并提出相應(yīng)的改進(jìn)方向，以期為科學(xué)快速準(zhǔn)確地鑒定大豆品種，評(píng)價(jià)種質(zhì)資源和解決品種產(chǎn)權(quán)糾紛提供參考依據(jù)。

1 SSR指紋圖譜身份證技術(shù)概述

SSR分子標(biāo)記是一種建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的遺傳標(biāo)記，SSR標(biāo)記完全符合品種鑒別的4個(gè)基本準(zhǔn)則，即環(huán)境的穩(wěn)定性、品種間變異的可識(shí)別性、最小的品種內(nèi)變異和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。因此，可用來(lái)高效準(zhǔn)確地檢測(cè)生物體中的遺傳變異，在品種鑒定及種子檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。國(guó)外Ak?kaya等首先對(duì)大豆中的SSR標(biāo)記進(jìn)行了研究[10]，證明其具有高水平的多態(tài)性，在大豆基因組中，（AT）n和（ATT）n比較高。國(guó)內(nèi)許占有、邱麗娟等首先利用SSR標(biāo)記與農(nóng)藝性狀間的對(duì)比[11]，證明了利用SSR標(biāo)記鑒定大豆種質(zhì)的可行性。

SSR指紋圖譜通過(guò)比對(duì)不同品種SSR指紋圖譜照片中的差異可以達(dá)到鑒別品種間遺傳差異的目的[12]。該方法已廣泛應(yīng)用于大豆、水稻、玉米等農(nóng)作物品種的鑒定。關(guān)榮霞等以遺75-14、中黃14、中品662和中品661共4個(gè)品種為試驗(yàn)材料[13]，利用不同連鎖群上的SSR引物對(duì)其隨機(jī)選擇個(gè)體進(jìn)行分析，為大豆品種資源的保存及品種指紋圖譜的建立提供理論依據(jù)。Zhou等用水稻微衛(wèi)星標(biāo)記POS6.2H構(gòu)建了57個(gè)品種的指紋圖譜[14]，其中包括親緣關(guān)系較近的40個(gè)美國(guó)品種，能全部區(qū)分供試品種間的差異。吳渝生等利用SSR標(biāo)記建立了3個(gè)云南省推廣的玉米雜交種及其親本的標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜[15]，用于玉米品種鑒定，認(rèn)為SSR標(biāo)記具有很高的多態(tài)性，非常適用于品種鑒定研究。

SSR指紋圖譜身份證是隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而建立起來(lái)的應(yīng)用性的遺傳種質(zhì)分析方法，其在指紋圖譜的基礎(chǔ)上將品種特征數(shù)字化，使每個(gè)品種都擁有一個(gè)屬于自己的字符串形式的代碼，能夠更加簡(jiǎn)單明了地區(qū)分品種[16-18]。此外，SSR指紋圖譜身份證數(shù)據(jù)易于存檔記錄和分析比較[19-21]。

2 大豆品種SSR指紋圖譜身份證技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

隨著SSR分子標(biāo)記的不斷發(fā)掘和檢測(cè)技術(shù)的漸趨完善，SSR指紋圖譜身份證技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于大豆品種遺傳特異性的鑒定。高運(yùn)來(lái)等以黑龍江13個(gè)育種單位6個(gè)積溫帶的83份大豆品種為材料[22]，利用9對(duì)引物將參試大豆品種完全區(qū)分開(kāi)，據(jù)此構(gòu)建了一套黑龍江省大豆品種的分子身份證，并獲得全部品種的最優(yōu)分子特征。丁俊杰等以黑龍江省29個(gè)大豆育種單位的103份已鑒定大豆灰斑病3個(gè)生理小種抗性的大豆品種（系）為材料[23]，利用與大豆抗灰斑病基因連鎖的7個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建了供試品種（系）的分子身份證。何琳等以2012年黑龍江墾區(qū)區(qū)域試驗(yàn)的121份大豆品系為材料[24]，選用10對(duì)SSR標(biāo)記就可將參試品系完全區(qū)分開(kāi)，并構(gòu)建了121份大豆參試品系的分子身份證。何琳等以長(zhǎng)江流域國(guó)家區(qū)試的45份大豆品種為材料[25]，選擇6對(duì)SSR標(biāo)記將參試大豆品種全部區(qū)分開(kāi)，并獲得唯一的分子身份證。以上指紋圖譜身份證研究結(jié)果都能夠準(zhǔn)確反映供試大豆品種（系）間的遺傳差異，并為分子水平上區(qū)分鑒別大豆品種（系）提供了參考依據(jù)。

目前，已報(bào)道的大豆品種SSR指紋圖譜身份證技術(shù)流程主要如下：首先，提取并純化大豆植株葉片的總DNA；其次，根據(jù)大豆公共遺傳圖譜，對(duì)20個(gè)連鎖群上均勻分布的、數(shù)量較多的SSR引物進(jìn)行初步篩選；第三，保留擴(kuò)增清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性較高、片段大小適中的引物作為下一步分析的SSR核心引物；第四，根據(jù)電泳條帶大小，用數(shù)字依次記錄每一個(gè)品種材料用SSR核心引物擴(kuò)增后的等位基因；第五，依據(jù)核心引物的平均等位變異頻率，確定用于構(gòu)建SSR指紋圖譜身份證的標(biāo)準(zhǔn)核心引物；最后，將標(biāo)準(zhǔn)核心引物在不同品種中擴(kuò)增出的所有不同帶型進(jìn)行數(shù)字化標(biāo)識(shí)，即為SSR指紋圖譜身份證。

3 現(xiàn)有SSR指紋圖譜身份證技術(shù)存在的問(wèn)題與改進(jìn)方向

3.1 SSR指紋圖譜身份證編碼原則的合理性

目前已報(bào)道的大豆品種指紋圖譜身份證都采取了相同的編碼原則，即根據(jù)SSR標(biāo)記擴(kuò)增片段的大小，對(duì)應(yīng)的分子量從大到小，依次記錄為1，2，3，...，n，然后直接規(guī)定了第N個(gè)標(biāo)記引物的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)應(yīng)分子身份證的第N位。雖然以上編碼方式可以保證指紋圖譜身份證每位都只對(duì)應(yīng)1位數(shù)，且書(shū)寫(xiě)十分簡(jiǎn)潔，但仍存在不足之處，即當(dāng)SSR擴(kuò)增譜帶繁多、分布復(fù)雜時(shí)，該記錄、編碼方法易出現(xiàn)讀帶誤差且統(tǒng)計(jì)困難等情況。針對(duì)這一問(wèn)題，有研究者在小麥、油菜等作物上提出了根據(jù)每對(duì)SSR擴(kuò)增的帶型間的差別，直接對(duì)帶型進(jìn)行整體編號(hào)，該方法可以避免人工統(tǒng)計(jì)所引起的誤差，并有效簡(jiǎn)化SSR帶型的記錄[26-27]。在今后的大豆品種SSR指紋圖譜身份證構(gòu)建工作中，也可以借鑒上述編碼原則，使每種引物在供試材料中擴(kuò)增的不同帶型都有一個(gè)對(duì)應(yīng)的數(shù)字標(biāo)識(shí)，提高SSR擴(kuò)增條帶的可讀性[28-29]。

3.2 SSR指紋圖譜身份證數(shù)據(jù)的可擴(kuò)充性

目前已報(bào)道的大豆品種SSR指紋圖譜身份證構(gòu)建時(shí)使用的標(biāo)記數(shù)量并不是很多，然而所用標(biāo)記根本無(wú)法實(shí)現(xiàn)DNA序列的全覆蓋，對(duì)于可預(yù)見(jiàn)的變異還沒(méi)有一定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[30-31]。在今后的指紋圖譜身份證構(gòu)建工作中，應(yīng)該考慮在不同連鎖群上隨機(jī)、均勻地挑選多態(tài)性的引物，這樣對(duì)于身份證的準(zhǔn)確性和后續(xù)身份證數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)容都具有重要意義[23,32]。此外，隨著品種數(shù)量的增加，現(xiàn)有標(biāo)記組合無(wú)法滿(mǎn)足品種鑒定的需求，造成已構(gòu)建的指紋圖譜身份證數(shù)據(jù)庫(kù)的局限性日益擴(kuò)大，這就需要考慮增加新的有效核心標(biāo)記引物的數(shù)量，甚至借助國(guó)外的分子指紋圖譜研究成果，進(jìn)一步豐富、完善數(shù)據(jù)庫(kù)，從而確保指紋圖譜身份證數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性、及時(shí)性和實(shí)用性[33-34]。

雖然目前大部分農(nóng)作物的SSR指紋圖譜身份證已相繼構(gòu)建，但這僅僅是對(duì)分子標(biāo)記數(shù)據(jù)的數(shù)字化，并不能完全表示一個(gè)品種包含的所有信息。劉新龍等借鑒國(guó)家居民身份證的格式[33]，將品種的國(guó)圃號(hào)、國(guó)家地區(qū)、育種單位、引物名稱(chēng)和分子數(shù)據(jù)有序地整合在一起，形成每個(gè)品種唯一的識(shí)別代碼，從這個(gè)指紋身份證代碼，研究者可以很方便地獲取品種的重要信息和分子數(shù)據(jù)用于品種區(qū)分鑒定研究。鑒于品種是育種工作的產(chǎn)物，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，具有商品屬性。因此，應(yīng)結(jié)合其重要的商品屬性，將品種的商品信息與指紋信息相結(jié)合，才能更加準(zhǔn)確定位描述一個(gè)品種的全部身份信息[27,33,35]。

3.3 SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)收集、分析的準(zhǔn)確性和高效性

目前在構(gòu)建大豆SSR指紋圖譜身份證時(shí)，SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)主要是通過(guò)常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染技術(shù)的檢測(cè)方法獲得，然后依靠人工比對(duì)分析標(biāo)記引物擴(kuò)增數(shù)據(jù)。當(dāng)供試材料和位點(diǎn)較多時(shí)，以上數(shù)據(jù)收集和分析方法顯得費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不同膠板間數(shù)據(jù)的整合與統(tǒng)計(jì)更是一項(xiàng)繁瑣的工作，結(jié)果的準(zhǔn)確性也很難保證[36-37]。最近發(fā)展起來(lái)的熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)，利用熒光檢測(cè)器對(duì)標(biāo)記有熒光染料的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行信號(hào)采集，并通過(guò)毛細(xì)管電泳自動(dòng)讀取分析產(chǎn)物片段大小[38]。借助該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)SSR標(biāo)記與高效、自動(dòng)化技術(shù)的結(jié)合，不但可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)銀染法人工讀膠板的繁瑣工作，保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，而且可有效解決不同實(shí)驗(yàn)室間的數(shù)據(jù)整合問(wèn)題，特別適用于大量供試材料的規(guī)?；瘷z測(cè)分析[36]。隨著分析檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和普及，考慮到檢測(cè)效率和可比性?xún)?yōu)勢(shì)，可考慮采用如熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)作為分析手段，實(shí)現(xiàn)高精度及高通量地構(gòu)建大豆SSR指紋圖譜身份證[39-40]。

3.4 指紋圖譜身份證在鑒別實(shí)質(zhì)性派生品種上的應(yīng)用

“實(shí)質(zhì)性派生品種”是國(guó)際植物品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）提出的概念，指的是由原始品種通過(guò)選育、天然或誘導(dǎo)的突變、體細(xì)胞克隆、基因?qū)?、同親本回交而得出的新品種[30]?？偟膩?lái)說(shuō)，從形態(tài)學(xué)上很難將實(shí)質(zhì)性派生品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，只能借助大量分子標(biāo)記的篩選，從遺傳學(xué)角度鑒別出他們之間的細(xì)微差別和相互遺傳關(guān)系。此外，由于SSR擴(kuò)增的目的片段多來(lái)自編碼基因之間的序列，利用SSR標(biāo)記區(qū)分實(shí)質(zhì)性派生品種本身就存在困難[41]。今后，在利用指紋圖譜身份證技術(shù)鑒別實(shí)質(zhì)性派生品種的工作中，一方面可以考慮選擇較高區(qū)分效率或特異區(qū)分能力的引物，另一方面可以考慮利用不同類(lèi)型分子標(biāo)記之間的互補(bǔ)來(lái)綜合鑒別。此外，如何定義實(shí)質(zhì)性派生品種間遺傳差異的變異幅度也是一個(gè)值得深入探討的問(wèn)題[42-43]。

4 展望

比較于傳統(tǒng)田間種植鑒定方法，指紋圖譜身份證技術(shù)在鑒別品種間差異方面，具有簡(jiǎn)單明了、不受環(huán)境影響等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。但由于目前獲得的與表型性狀相應(yīng)的SSR分子標(biāo)記數(shù)量十分有限，且SSR標(biāo)記主要擴(kuò)增的是與表型性狀關(guān)系不大的非編碼序列[30,44-45]，這就導(dǎo)致在品種鑒別時(shí)，通過(guò)選用具體分子標(biāo)記獲得的指紋圖譜身份證結(jié)果，在表型特征方面存在一定缺陷。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)于基因功能的深入研究，有可能在標(biāo)記與性狀之間找到更緊密和相關(guān)的聯(lián)系，使得傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定與分子標(biāo)記鑒定緊密結(jié)合，最終建立更加完善的品種特異身份證技術(shù)體系，為品種在分子水平上的鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供可靠的科學(xué)依據(jù)[40,46-47]。

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