周留勇 尤建良 單珍珠 張辰岑 龔時(shí)夏

(無錫市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，無錫，214071)

復(fù)脈膏外敷對大鼠長春瑞濱外滲性損傷組織中VEGF的影響

周留勇 尤建良 單珍珠 張辰岑 龔時(shí)夏

(無錫市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，無錫，214071)

目的：建立大鼠長春瑞濱外滲性組織損傷的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在此動物模型上研究?fù)脈膏外敷對外滲性損傷組織中VEGF的影響，以探討復(fù)脈膏外敷治療化療性靜脈炎的療效及機(jī)制。方法:42只大鼠隨機(jī)分為2組：復(fù)脈膏組、50%硫酸鎂組，21只/組，建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?組大鼠左側(cè)損傷處分別予復(fù)脈膏外敷、50%硫酸鎂濕敷；右側(cè)予生理鹽水外敷作為對照組。在損傷后第1、4、7、11、14、18天，分別隨機(jī)取3只大鼠，切除損傷部位的皮膚及皮下組織，固定標(biāo)本，脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，采用免疫組化標(biāo)記及圖像分析方法，在電子顯微鏡下觀察VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果：VEGF陽性表達(dá)主要見于表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、毛囊上皮細(xì)胞胞漿、滲出的巨噬細(xì)胞、增生的成纖維細(xì)胞胞漿。復(fù)脈膏外敷較硫酸鎂濕敷及生理鹽水外涂能明顯刺激長春瑞濱外滲性損傷組織中VEGF的陽性表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論:復(fù)脈膏外敷于損傷皮膚后能上調(diào)損傷組織中VEGF的表達(dá)，通過VEGF的生物學(xué)功能，進(jìn)而促進(jìn)損傷組織的愈合。因此，復(fù)脈膏可以用于防治化療性靜脈炎。

復(fù)脈膏；長春瑞濱；外滲性損傷；VEGF

癌癥是危害人類健康的三大主要疾病之一，靜脈點(diǎn)滴化療藥物是目前治療癌癥的重要方法之一。但絕大多數(shù)化療藥物對靜脈有刺激作用，部分強(qiáng)刺激性的化療藥物易引起靜脈炎，進(jìn)而增加患者的痛苦，降低患者的生活質(zhì)量，甚至影響化療的順利進(jìn)行。所以，腫瘤內(nèi)科醫(yī)護(hù)人員必須重視：如何預(yù)防或減輕化療性靜脈炎，以保證化療方案的順利實(shí)施。

靜脈點(diǎn)滴化療藥物會產(chǎn)生對血管的刺激，進(jìn)而引起管壁的各種化學(xué)性炎癥，常導(dǎo)致不同程度化療性靜脈炎的發(fā)生[1-4]。外周靜脈單純輸注長春瑞濱引起的靜脈炎甚至高達(dá)89.5%[5]。

我科使用中藥制劑“復(fù)脈膏”預(yù)防和治療化療性靜脈炎20余年，療效顯著，無明顯不良反應(yīng)。為了探討復(fù)脈膏防治化療性靜脈炎的機(jī)理，為臨床使用提供確鑿有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，我們進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)將復(fù)脈膏外敷對大鼠長春瑞濱外滲性損傷組織中VEGF的影響的實(shí)驗(yàn)研究，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠60只，雌雄不限，(205±20)g/只，清潔級，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2007-0001。

1.2 主要儀器 RM2135型石蠟切片機(jī)(德國LEICA公司)、CHK2-F-GS顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、BX41圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)。

1.3 主要試劑 復(fù)脈膏(由無錫市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供)，長春瑞濱注射液(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司出品，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H19990278，規(guī)格：10 mg/瓶)，50%硫酸鎂(上海鶴善實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司出品)，鼠單抗VEGF多克隆抗體(工作濃度1：150)、免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑(美國EPITOMICS公司出品)，安爾碘Ⅱ型皮膚消毒劑(上海利康消毒高科技有限公司，生產(chǎn)批號：20111105)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 皮膚準(zhǔn)備 用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，以股骨小頭為標(biāo)志，其上方1.5 cm處作為中心，采用刮毛刀刮除直徑約3.0 cm范圍毛，用溫清水洗凈脫毛部位皮膚，觀察48 h，脫毛部位皮膚完好。

2.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?1)取SD大鼠18只，隨機(jī)分為6組，3只/組，用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，安爾碘Ⅱ型皮膚消毒劑常規(guī)消毒，分別注射不同濃度(0.3、0.5、0.6、1.0、1.2、1.5 mg/mL)生理鹽水稀釋的長春瑞濱溶液，每只SD大鼠于左側(cè)皮下注射0.2 mL，右側(cè)皮內(nèi)注射0.2 mL。長春瑞濱注射劑量均在大鼠耐受范圍內(nèi)。2)理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拇_定：經(jīng)觀察和對照，將長春瑞濱稀釋成1.0 mg/mL，采取皮內(nèi)注射方式注射0.2 mL所形成的SD大鼠組織均一性損傷，確定為理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?見圖1)。

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟 1)取SD大鼠42只，隨機(jī)分為2組：硫酸鎂組、復(fù)脈膏組，21只/組。2)按上述理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拇_定方法，建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?)造模成功后1 h，2組SD大鼠左側(cè)損傷處分別予50%硫酸鎂濕敷(3次/d)、復(fù)脈膏0.2 g外敷(1次/d)；右側(cè)損傷處均予生理鹽水外敷作為對照組。共形成硫酸鎂組21處、復(fù)脈膏組21處、對照組42處。4)在損傷后的第1、4、7、11、14、18天，2組SD大鼠分別隨機(jī)取3只，予3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，常規(guī)消毒，切取外滲性損傷部位的皮下組織及皮膚(取皮膚創(chuàng)面及周圍5 mm左右寬的組織)，生理鹽水清洗，4%中性低聚甲醛緩沖固定液固定標(biāo)本，固定48 h后，常規(guī)脫水、浸潤、石蠟包埋，后連續(xù)切片。5)采用SP法：將上述所得切片，脫蠟至水，予3%雙氧水以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，予非免疫兔血清以封閉，后在一抗4 ℃濕溫盒中過夜，及二抗37 ℃溫箱中30 min，DAB顯色劑顯色，予蘇木精以復(fù)染，并透明封片。陰性對照采用PBS緩沖液代替一抗。判定以胞漿出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。

圖1 大鼠長春瑞濱外滲性損傷組織的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?大鼠右側(cè))

2.4 VEGF的表達(dá) 采用免疫組化標(biāo)記和圖像分析法。在電子顯微鏡下，觀察VEGF的表達(dá)情況，分別在皮下組織、真皮及表皮三處高倍(×100)下各取3個視野，應(yīng)用Image Pro Plus 5.0專業(yè)分析軟件測出陽性細(xì)胞的積分光密度(integrated oPtical density，IOD)并取均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件包處理，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

硫酸鎂組、復(fù)脈膏組2組損傷組織中不同時(shí)間點(diǎn)VEGF積分光密度IOD的表達(dá)情況及組內(nèi)、組間的比較。(見表1、圖5)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：VEGF陽性表達(dá)主要見于增生的成纖維細(xì)胞胞漿、滲出的巨噬細(xì)胞、毛囊上皮細(xì)胞胞漿、血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞。根據(jù)表1、圖5，可知：各組VEGF的IOD值在損傷后第1天就開始升高，其中硫酸鎂組及復(fù)脈膏組左側(cè)均在第4天升高明顯，第7天升到高峰(見圖2、3)，但復(fù)脈膏組左側(cè)VEGF的IOD值明顯高于硫酸鎂組左側(cè)，并且在第11天后才開始降低，持續(xù)時(shí)間較硫酸鎂組長；硫酸鎂組及復(fù)脈膏組右側(cè)均在第4天升到高峰(見圖4)，第7天即開始下降，其高峰值較2組左側(cè)均低。

圖2 復(fù)脈膏組左側(cè)d7(VEGF×100)

圖3 硫酸鎂組左側(cè)d7(VEGF×100)

圖4 復(fù)脈膏組右側(cè)d4(VEGF×100)

組別左側(cè)IOD 右側(cè)IOD P值硫酸鎂組D1192.44±11.91186.94±9.79P=0.237>0.05D4311.34±14.79329.74±10.77D7343.11±10.72296.00±14.00D11269.77±8.88254.56±11.58D14197.27±12.41178.48±11.64D18144.69±10.79141.83±8.34復(fù)脈膏組D1210.26±14.43184.44±10.49P=0.006<0.01D4490.88±12.45334.74±12.18D7527.84±16.62292.50±11.88D11485.94±11.10247.06±8.93D14326.23±11.30173.54±7.35D18251.49±8.81144.84±9.76P=0.005<0.01P=0.415>0.05

圖5 2組不同時(shí)間點(diǎn)VEGF積光分密度IOD線形圖

由表1可知：硫酸鎂組損傷組織中左側(cè)與右側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)VEGF積分光密度IOD值比較，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示：50%硫酸鎂濕敷未能明顯刺激損傷組織中VEGF的IOD值升高；而復(fù)脈膏組損傷組織中左側(cè)與右側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)VEGF積分光密度IOD值比較，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示：復(fù)脈膏外敷能明顯刺激損傷組織中VEGF的IOD值升高。

由圖5可知：2組右側(cè)損傷組織中不同時(shí)間點(diǎn)VEGF的IOD值曲線近乎重合，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明：本實(shí)驗(yàn)可重復(fù)；硫酸鎂組左側(cè)與復(fù)脈膏組左側(cè)損傷組織中不同時(shí)間點(diǎn)VEGF積分光密度IOD值比較，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明：復(fù)脈膏外敷較50%硫酸鎂濕敷能明顯刺激損傷組織中VEGF的IOD值升高。因此，復(fù)脈膏外敷較生理鹽水外涂及50%硫酸鎂濕敷更能刺激外滲性損傷組織中VEGF的陽性表達(dá)。

4 討論

長春瑞濱為一種半合成長春堿類化合物，其抗腫瘤機(jī)制為阻滯微管蛋白聚合成微管并誘導(dǎo)微管解聚，干擾細(xì)胞有絲分裂達(dá)到抗腫瘤作用，屬于細(xì)胞周期特異性藥物[6]。長春瑞濱具有高滲透性，可透過血管滲入皮下組織間隙，可直接刺激神經(jīng)末梢，同時(shí)藥物刺激可引起局部炎癥性反應(yīng)，引起患者劇烈疼痛；能破壞細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓平衡，使pH值改變而引起靜脈炎或毛細(xì)血管痙攣，局部供血減少導(dǎo)致組織缺血、缺氧，局部出現(xiàn)水泡，形成硬結(jié)和潰瘍[7]。長春瑞濱是治療晚期非小細(xì)胞肺癌的有效藥物之一，因藥物價(jià)格比較低廉，尤適用于經(jīng)濟(jì)較不富裕的老年患者單藥化療。長春瑞濱聯(lián)合順鉑也是晚期非小細(xì)胞肺癌最有效的聯(lián)合化療方案之一，適用于一般狀況較好的患者。長春瑞濱對乳腺癌、食管癌、頭頸部癌及淋巴瘤有效，與其他化療藥物聯(lián)合使用廣泛用于這些晚期腫瘤的化療[8]。

我院著名腫瘤專家、全國名老中醫(yī)藥專家傳承指導(dǎo)老師趙景芳教授，腫瘤科科主任、全國勞模尤建良教授，總結(jié)自己20余年的臨床實(shí)踐和臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為：化療性靜脈炎當(dāng)屬中醫(yī)“惡脈”“脈痹”等范疇，是因藥石攻伐，傷及脈絡(luò)，熱、濕、毒邪外侵，氣滯血瘀，脈絡(luò)不通，終致熱、瘀、濕三者搏結(jié)脈道，外聚肌膚，進(jìn)而紅、腫、熱、痛諸癥叢生。治則當(dāng)以清熱解毒、活血化瘀、祛濕散結(jié)、通絡(luò)止痛、扶正祛邪為大法。根據(jù)這些認(rèn)識，創(chuàng)立中藥制劑“復(fù)脈膏”，并形成穩(wěn)定的院內(nèi)自制制劑。

復(fù)脈膏由生大黃、野菊花、三棱、莪術(shù)、丹參、乳香、沒藥、黨參、冰片組成。其中，生大黃清熱解毒，活血祛瘀，瀉下攻積，清熱利濕，達(dá)到祛瘀生新之功效，是為君藥；野菊花清熱解毒，三棱、莪術(shù)破血逐瘀、行氣消積、止痛，共為臣藥，輔助君藥以清熱解毒、活血祛瘀、消結(jié)止痛；丹參活血化瘀，涼血消癰，乳香、沒藥活血止痛，消腫生肌，共為佐藥，佐助君藥以清熱解毒、活血祛瘀、祛濕消結(jié)，通絡(luò)止痛；黨參益氣、生津、養(yǎng)血，亦為佐藥，佐助君藥以扶正助祛邪；冰片清熱解毒，消腫止痛，性善走竄開竅，無往不達(dá)，是為使藥[9]。

現(xiàn)代藥理研究表明[9-11]：生大黃、莪術(shù)、野菊花、沒藥、乳香、丹參、冰片均具有一定程度的抗炎、抗菌作用；生大黃、丹參、三棱、莪術(shù)均可改善微循環(huán)、抑制血小板、抗血栓形成；丹參、三棱、乳香、冰片、沒藥有止痛作用；黨參、莪術(shù)有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。

血管內(nèi)皮因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是一種促血管生長因子，廣泛存在于組織細(xì)胞中，有很強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular Endothelial Cells，VEC)增殖、促新生血管生長的功能。VEGF在生理和病理?xiàng)l件下均有表達(dá)。生理?xiàng)l件下，很多正常組織中都有表達(dá)，但表達(dá)水平一般較低。病理?xiàng)l件下，如腫瘤、損傷愈合等疾病中過量表達(dá)[12-15]。

VEGF的作用[12-15]：1)促VEC增殖：這是VEGF的主要作用。VEGF是一種VEC特異性促絲裂原，具有強(qiáng)烈的促VEC增殖作用。特別是當(dāng)VEC損傷時(shí)，VEGF能促進(jìn)損傷VEC迅速增生，減輕損傷VEC的功能阻礙，促進(jìn)新生血管形成，加速創(chuàng)傷愈合。2)間接地阻止血管平滑肌的增殖與遷移：對防止血管再狹窄有重要意義。3)增加血管通透性：VEGF能極強(qiáng)地增加血管的通透性。4)抗血栓形成：VEGF可促進(jìn)VEC的愈合，間接的抗血管內(nèi)血栓的形成。5)其他：VEGF能激活單核細(xì)胞，并促進(jìn)其遷移，這對組織炎癥、血管新生、組織重構(gòu)等均有重要作用。

VEGF是一種以血管內(nèi)皮細(xì)胞為作用靶點(diǎn)的多功能細(xì)胞因子[12-15]，研究認(rèn)為VEGF通過促進(jìn)表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，而密切參與創(chuàng)傷的修復(fù)過程；創(chuàng)傷是VEGF表達(dá)的一個重要誘因，VEGF的高表達(dá)能促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合[16]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在成纖維細(xì)胞胞漿、滲出的巨噬細(xì)胞、毛囊上皮細(xì)胞胞漿、血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞等均有表達(dá)。復(fù)脈膏外敷損傷組織中VEGF的表達(dá)要高于50%硫酸鎂濕敷及生理鹽水外涂，同時(shí)觀察到2組各側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的平均皮損面積提示：復(fù)脈膏外敷較50%硫酸鎂濕敷及生理鹽水外涂能明顯減小各時(shí)間點(diǎn)的平均皮損面積。

綜上可知，復(fù)脈膏外敷于損傷皮膚后能上調(diào)損傷組織中VEGF的表達(dá)，通過VEGF的生物學(xué)功能，進(jìn)而促進(jìn)損傷組織的愈合。因此，復(fù)脈膏可以用于防治化療性靜脈炎。

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(2014-04-13收稿 責(zé)任編輯：曹柏)

Effects of Fumai Paste on VEGF of Tissue in Vinorelbine- induced Extravasation Injury Model Rats

Zhou Liuyong，You Jianliang，Shan Zhenzhu,Zhang Chencen,Gong Shixia

(OncologyDepartment,WuxiHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuxi214071,China)

Objective:To establish an ideal animal experiment model of vinorelbine-induced extravasation injury to study effects of Fumai Paste on VEGF of tissue,and explore the curative effect and mechanism of treating chemotherapeutic phlebitis with external application of Fumai Paste.Methods:Forty-two rats were randomly divided into two groups with 21 rats in each group.Each rat was established to experimental model.Rats in Fumai Paste group were treated with external application of Fumai Paste on left side; and rats in magnesium sulfate groiup were treated with hydropathic compress of 50% magnesium sulfate on left side.The right side of rats in both groups were treated with hydropathic compress of normal saline.Three rats were selected randomly from each group on day 1,day 4,day 7,day 11,day 14 and day 18,and the skin and subcutaneous tissue of extravasation injury of each rat was cut off.All specimens were fixed in formalin,dehydrated,embedded in paraffin and serially cut.All specimens were observed expressions of VEGF under the electron microscope by immunohistochemical assay and image analysis method.Results:The positive expression of VEGF was major in epidermic cells,vascular endothelial cell,endochylema of hair follicle cells,macrophage,endochylema of fibroblast.Fumai Paste could stimulate the positive expression of VEGF tissue of animal experiment model with vinorelbine-induced extravasation injury more than 50% magnesium sulfate and normal saline (P<0.01).Conclusion:Fumai Paste can up-regulate the expression of VEGF tissue of animal experiment model with vinorelbine-induced extravasation injury.With the biological function of VEGF,Fumai Paste can accelerate the healing of the damaged tissues.Hence,chemotherapeutic phlebitis can be prevented and treated with external application of Fumai Paste.

Fumai Paste; Vinorelbine; Extravasation injury; VEGF (vascular endothelial growth factor)

無錫市科學(xué)技術(shù)局科技支撐-社會發(fā)展項(xiàng)目(編號：CSE01019)

周留勇(1978.1—)，男，江蘇省如皋市人，副主任中醫(yī)師，碩士研究生，現(xiàn)工作于無錫市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，主要從事惡性腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合治療研究，E-mail：zhou-liuyong@163.com

尤建良(1963.2—)，男，江蘇省無錫市人，主任中醫(yī)師，南京中醫(yī)藥大學(xué)教授、碩士生導(dǎo)師，無錫市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科主任，主要從事惡性腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合治療研究，E-mail：YJL1104@21cn.com

R332;R273

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.020