楊蓮芳

陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安710003)

·方藥縱橫·

HPLC法測定夜關(guān)門藥材中槲皮素的含量

楊蓮芳

陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安710003)

目的：建立夜關(guān)門藥材中槲皮素含量的測定方法。方法：采用HPLC法，色譜柱：Agilent HC-C18(150mm×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇-0.3%磷酸水溶液(55∶45)；檢測波長370nm；流速：1mL·min-1。結(jié)果：槲皮素在1.84μg·mL-1～18.4μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系(r=0.9992)；平均回收率為97.7%，RSD=1.99%。結(jié)論：建立的方法靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可有效控制夜關(guān)門藥材的質(zhì)量。

夜關(guān)門，又名：截葉鐵掃帚、絹毛胡枝子等，豆科胡枝子屬。有補(bǔ)肝腎，益肺陰，散瘀消腫的功效。全草藥用，治遺精，遺尿，白濁，白帶，哮喘，胃痛，勞傷，小兒疳積，瀉痢，跌打損傷，視力減退，目赤，乳癰[1]。含黃酮類、蒎立醇、酚性成分、鞣質(zhì)以及β-谷甾醇等成分[2]。黃酮類成分是其主要活性成分之一，具有心腦缺血損傷、肝損傷、心律失常的保護(hù)作用及其鎮(zhèn)痛,抗自由基和抗腫瘤等作用[3]，因此，夜關(guān)門藥材中黃酮類物質(zhì)含量的高低直接影響其藥用價(jià)值。槲皮素作為黃酮類化合物的代表成分[4]，為此我們采用HPLC法測定了夜關(guān)門藥材中槲皮素的含量[5]，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法靈敏、快速、簡便、結(jié)果穩(wěn)定，可為該藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀(1260型，安捷倫)；紫外可見分光光度計(jì)(UV-2012型，尤尼柯(上海)儀器有限公司)；酸度計(jì)(PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；超聲波清洗器(KQ-5200E型，昆山市超聲儀器有限公司)；精密電子天平(ALC-210.4型，賽多利斯)；KIZ-UV艾柯超純水機(jī)(成都艾柯純水機(jī)廠)。

1.2 試劑 槲皮素對照品(西安應(yīng)化生物技術(shù)有限公司，批號：Qt120428)；夜關(guān)門藥材(購自藻露堂中藥店)；甲醇、乙腈為色譜純；無水乙醇、三乙胺為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 槲皮素對照品溶液的制備：精密稱定對照品槲皮素1.84mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，即得(濃度為36.8μg·mL-1)。

2.1.2 供試品溶液的制備：取夜關(guān)門藥材約3g，粉碎成細(xì)粉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25mL 80%的甲醇溶液，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用濃度80%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10mL，加入1mL鹽酸，置90℃水浴中加熱回流1h，取出，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加濃度80%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液[4]。

2.1.3 空白對照溶液的制備：取除夜關(guān)門藥材之外的其余成分，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測波長的選擇：取槲皮素對照品的甲醇溶液，在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，掃描結(jié)果顯示槲皮素在200～400nm有三個吸收峰，分別在215nm、255nm和370nm處，其中210nm處溶劑甲醇有末端吸收，干擾較大，250nm處的峰太尖，測定時誤差較大，370nm處峰吸收較強(qiáng)且較平緩，故選370 nm作為槲皮素含量測定的檢測波長，見圖1。

圖1 槲皮素的甲醇溶液在200～400nm范圍內(nèi)的UV圖譜

2.2.2 流動相的選擇：分別以甲醇-水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.3%磷酸水溶液和甲醇-0.5%磷酸水溶液作為流動相[2-5](比例均為50∶50)，將槲皮素對照品溶液分別進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)隨著水相中磷酸濃度的增加，槲皮素色譜峰的對稱因子逐漸變大，但甲醇-0.3%磷酸水溶液和(比例均為50∶50)為流動相的色譜峰無顯著差異，故選擇甲醇-0.3%磷酸水溶液為流動相組成。然后分別以甲醇-0.3%磷酸水溶液(50∶50、52：48和55∶45)為流動相，將槲皮素對照品溶液分別進(jìn)樣分析，結(jié)果當(dāng)本實(shí)驗(yàn)的流動相為甲醇-0.3%磷酸水溶液(50∶50)時，槲皮素色譜峰有一定拖尾，且保留時間偏長；調(diào)整流動相比例至(52∶48)，槲皮素的色譜峰峰拖尾情況有所改善，保留時間提前，對稱因子也略有提高，但是仍不理想；調(diào)整流動相的比例至(55∶45)，發(fā)現(xiàn)槲皮素色譜峰的對稱因子達(dá)到了接近0.95，保留時間為6min左右；在此色譜條件下，將供試品溶液進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)，槲皮素色譜峰能與溶劑峰以及雜質(zhì)峰完全分開，因此選定流動相為甲醇-0.3%磷酸水溶液(55∶45)。

2.2.3 色譜柱溫度的選擇：本實(shí)驗(yàn)分別考察了20℃、25℃、30℃柱溫下的分離效果，結(jié)果顯示，柱溫越低，色譜峰的出峰時間越長，但柱溫過高會影響儀器和色譜柱的壽命。25℃下所測成分能與其他成分達(dá)到完全分離，故選擇25℃為測定溫度。

2.2.4 流速的選擇：本實(shí)驗(yàn)選擇流速為1.0mL/min，此為高效液相分析中常用的流速，流速太高不利于儀器和色譜柱的保護(hù)，太低會使各個色譜峰的保留時間延長。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：分別精密吸取槲皮素對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各20μL注入高效液相色譜儀測定，色譜圖見圖2。槲皮素的保留時間約為5.9min，與其他組分分離度好，空白對照溶液在槲皮素色譜峰位置無干擾。

A-對照品 B-供試品 C-空白對照

圖2 夜關(guān)門藥材的HPLC圖譜

2.2.6色譜柱進(jìn)樣量的選擇 由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法定量時，以定量環(huán)或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。本試驗(yàn)采用20μL定量環(huán)進(jìn)行定量分析，以消除進(jìn)樣量誤差。

2.2.7色譜條件的確定：色譜柱：Agilent HC- C18柱(4.6mm150mm,5μm)；流動相：甲醇-0.3%磷酸水溶液(55∶45)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：370nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：20μL。該色譜條件下，槲皮素保留時間為5.9min，樣品中其他成分不影響測定。理論板數(shù)按槲皮素計(jì)算，不低于3500。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系的考察：分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下槲皮素對照品溶液(濃度為36.8μg·mL-1)0.5、1、2、3、4、5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備成一系列槲皮素對照品溶液，濃度分別為1.84μg·mL-1、3.68μg.mL-1、7.36μg·mL-1、11.04μg·mL-1、14.72μg·mL-1、18.40μg·mL-1的系列對照品溶液。精密吸取上述溶液20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以槲皮素對照品溶液的濃度(X)為橫坐標(biāo)，槲皮素峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=56.19X-107.7，r=0.9992，槲皮素濃度在1.84μg·mL-1～18.4μg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn)：精密吸取同一槲皮素對照品溶液，按“2.2.7”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣20μL，記錄HPLC圖譜中槲皮素的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD為2.14%，上述結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)：取夜關(guān)門藥材5份，每份約3g，精密稱定，分別照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20μL，按“2.2.7”項(xiàng)下色譜條件測定其峰面積，求其槲皮素含量，計(jì)算平均含量為101.7μg·g-1，RSD為1.79%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取同一夜關(guān)門藥材供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12h，按“2.2.7”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測定，進(jìn)樣體積為20μL，測定其峰面積，求得槲皮素峰面積的平均值為168.5，RSD為1.12 %，表明供試品溶液中槲皮素在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)：精密量取已知含量的夜關(guān)門藥材供試品溶液9份，分別精密加入低、中、高濃度的三種槲皮素對照品溶液(每個濃度平行做3份)，按本法測定，分別計(jì)算加樣回收率和RSD，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，槲皮素的回收率均在93.4%～100.6%之間，平均回收率為97.7%，說明本方法的準(zhǔn)確性良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.4 夜關(guān)門藥材中槲皮素的含量測定 取夜關(guān)門藥材三份，每份約3g，精密稱定，照“2.1.2”方法制備供試品溶液，分別用微孔濾膜(0.45μm)過濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣體積20μL，按“2.2.7”項(xiàng)下色譜條件測定其峰面積，求其槲皮素含量，結(jié)果見表2。

表2 含量測定結(jié)果

經(jīng)過對三份夜關(guān)門藥材測定，結(jié)果夜關(guān)門中槲皮素含量在100.3μg·g-1～104.1μg·g-1范圍內(nèi)，槲皮素平均含量為102.3μg·g-1。

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

3.1.1 關(guān)于供試品溶液的制備。①溶劑的選擇。分別以甲醇和乙醇作為提取溶劑提取夜關(guān)門藥材中的槲皮素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的提取率比后者更高。②提取方法的選擇。分別采用超聲波提取法和回流提取法進(jìn)行提取，對比發(fā)現(xiàn)后者提取率更高，且更有利于夜關(guān)門藥材中的蘆丁分解為槲皮素。故確定供試品溶液的制備為“2.1.2”項(xiàng)下方法。

3.1.2 關(guān)于夜關(guān)門藥材中槲皮素的含量。由于藥材中化學(xué)成分的含量可受到產(chǎn)地、采收季節(jié)、批次以及品質(zhì)等影響，故本文所測夜關(guān)門中槲皮素的含量尚不具有廣泛性，具體需在后期研究中作進(jìn)一步考察。

3.2 結(jié)論

本文采用高效液相色譜法測定了夜關(guān)門藥材中槲皮素的含量，該法靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為夜關(guān)門藥材的含量測定方法。

[1] 劉杰書,李泳鋒.土家苗藥夜關(guān)門功能的本草學(xué)研究與思考[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(01)：55-59.

[2] 張 芳,張維民,邱麗筠.鐵掃帚化學(xué)成分研究[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2008,30(3)：53-55.

[3] 朱曉勤，鄭孟蘇.截葉鐵掃帚不同藥用部位提取物體外抗氧化活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(1)：166-168.

[4] 孟德勝,汪士良.槲皮素及其苷類研究進(jìn)展[J].中國藥房,2012,11(5)：232-233.

[5] 林小明,韋寶含,韋平原,等.槲皮素及其制劑含量測定方法的研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(1)：101-102.

(收稿2015-03-26；修回2015-06-18)

Determination of quercetin in Crneate Lespedeza by HPLC

Shaanxi provincial hospital of TCM (Xi’an710003)

Yang Lianfang

Objective：To establish the method for determination of quercetin in Crneate Lespedeza.Methods：The content of quercetin was determined by HPLC.The column was Agilent HC-C18 column (150mm×4.6mm,5μm).The mobile phase was Methanol and 0.3% phosphoric acid solution (55∶45).The detection wavelength was 370 nm.The flow rate was 1 mL·min-1.Results： Linearity range of quercetin was 1.84μg·mL-1～18.4μg·mL-1(r=0.9992).The average recovery was 97.7% and RSD was 1.99%.Conclusion： The methods are proved to be simple,accurate and reproducible.It can effectively control the quality of Crneate Lespedeza.

Crneate Lespedeza Quercetin Determination HPLC

夜關(guān)門藥材 槲皮素 含量 色譜法，高壓液相

R965

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.10.085