駱靜怡，傅威銳，潘程遠(yuǎn)

木腐真菌的鑒定及對(duì)不同木材的腐朽能力

駱靜怡，傅威銳，潘程遠(yuǎn)

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安311300）

木腐真菌是一類木質(zhì)纖維素的自然分解者，在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮著重要角色。利用真菌子實(shí)體、菌落、菌絲體和分生孢子形態(tài)，結(jié)合內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列，對(duì)環(huán)境中采集到的木腐真菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)分離鑒定到的真菌進(jìn)行木質(zhì)素酶和纖維素酶活性分析，以及木材侵染腐朽能力研究。通過(guò)鑒定，共分離得到 5種木腐真菌，分別是尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum，毛栓孔菌 Trametes hirsuta，層生鐮刀菌Fusarium proliferatum，裂褶菌Schizophyllum commune和血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus。酶活分析表明：5種真菌均表現(xiàn)出較高的漆酶和錳過(guò)氧化物酶活性，但纖維素酶活性則普遍較低或不存在。利用質(zhì)量損失法分析5種真菌對(duì)6種不同木材樣品的生物降解能力，12周腐朽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：毛栓孔菌的木材腐朽能力較強(qiáng)，造成對(duì)橡木Quercus mongolica最高的69.16%的質(zhì)量損失率，而尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌和裂褶菌等的木材腐朽能力較弱，造成木材質(zhì)量損失率普遍低于3.00%，血紅密孔菌對(duì)不同木材的腐朽能力差異較大，可造成41.37%的橡木質(zhì)量損失率，而對(duì)柚木Tectona grandis僅有2.20%。通過(guò)分析酶活性和木材腐朽結(jié)果可以得出，真菌木質(zhì)纖維素酶活力和其木材腐朽能力不存在相關(guān)性，即較高的酶活力并不代表其具有較強(qiáng)的木材腐朽能力。圖5表2參36

木材科學(xué)與技術(shù)；木腐真菌；鑒定；木質(zhì)素酶；纖維素酶；木材腐朽

木腐真菌，即木材腐朽真菌，是一類能降解木質(zhì)纖維素的生物體，作為生態(tài)系統(tǒng)中的分解者，在物質(zhì)循環(huán)方面有著極為重要的作用。在中國(guó)，目前已分離鑒定到1 200余種木腐真菌［1-4］。按分類學(xué)地位，木腐真菌主要屬于擔(dān)子菌亞門(mén) Basidiomycotina非褶菌目 Polyporales子囊菌門(mén) Ascomycota盤(pán)菌綱Discomycetes和半知菌類的部分真菌［5］。從木材腐朽類型來(lái)看，木腐真菌可分為白腐真菌、褐腐真菌和軟腐真菌，其中，白腐真菌為最主要的木材腐朽菌，約占已知種類的90%［6］。木腐真菌對(duì)木材的腐朽，源于其能分泌木質(zhì)素酶和纖維素酶，將木材細(xì)胞壁中的木質(zhì)纖維素降解成低分子的物質(zhì)，并攝取這些物質(zhì)作為養(yǎng)分和能源，供其生長(zhǎng)和繁殖。不同種類的木腐真菌，其所分泌酶的種類和活性有所不同。黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium作為一種白腐真菌，其體內(nèi)具備降解木質(zhì)纖維素所有的相關(guān)基因［7］，但最被人們熟知的是其體內(nèi)高活性的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶［8］。同樣作為木質(zhì)纖維素降解體系中研究較多的云芝栓孔菌Trametes versicolor，其分泌的木質(zhì)纖維素酶主要是漆酶和錳過(guò)氧化物酶［9-10］。正因?yàn)椴煌靖婢哂胁煌拿赶导盎盍?，使得它們?duì)木材的侵染和分解能力各不相同［11-12］。木腐真菌作為自然界的分解者發(fā)揮著巨大的作用，但是對(duì)于木材的使用，卻造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究將對(duì)原木中采集的木腐真菌進(jìn)行分離鑒定，測(cè)定各種菌種木質(zhì)素酶（包括漆酶、錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶）和纖維素酶（包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶）的活性，同時(shí)比較菌種對(duì) 6種家居常用木材柚木 Tectona grandis，橡木 Quercus mongolica，菠蘿格 Intsia bijuga，杉木Cunninghamia lanceolata，花旗松Pseudotsuga menziesii和馬尾松Pinus massoniana等的腐朽能力，分析木腐真菌木質(zhì)纖維素酶酶活與其木材侵染能力的關(guān)系，為擴(kuò)展木腐真菌種質(zhì)資源、木材保護(hù)以及今后木腐真菌的利用提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 菌種采集、分離與保存

2012年12月12日，在浙江省臨安市馬溪木材廠采集木腐真菌子實(shí)體，分別裝于1.5 mL離心管中，并拍照記錄。通過(guò)組織分離法，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中分離得到5個(gè)菌株，編號(hào)為MX1，MX2，MX3，MX4和MX5，并保存于浙江農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)科微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 菌種形態(tài)與顯微觀察 挑取PDA上培養(yǎng)的真菌菌絲制作臨時(shí)載玻片，滅菌水作為介質(zhì)，在10× 40倍顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子及厚壁孢子的形態(tài)，用DS-Ri1數(shù)碼相機(jī)（Nikon）進(jìn)行顯微拍照。MX1菌株的顯微結(jié)構(gòu)為PDA上培養(yǎng)30 d的菌絲體，MX2，MX3，MX4和MX5菌株的顯微結(jié)構(gòu)為PDA上培養(yǎng)8 d的菌絲體。

1.2.2 菌種內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）及D1/D2序列分析 分別挑取PDA上培養(yǎng)8 d的MX1，MX2，MX3，MX4和MX5菌絲體，用EZ-10 Spin Column Fungal DNA Isolation Kit（生工生物）提取其基因組DNA，以提取的DNA為模板，用Fungi Identification PCR Kit（TaKaRa）試劑盒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增菌絲體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen）回收目的條帶，對(duì)回收的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。

1.3 粗酶液制備

刮取在PDA上培養(yǎng)14 d后的木腐真菌菌絲，加蒸餾水研磨，將研磨液離心（1 000 r·min-1，10 min，4℃）得到的上清液作為粗酶液。該粗酶液用于測(cè)定木質(zhì)素酶和纖維素酶的活力。

1.4 粗酶液總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

取上述各種真菌粗酶液用于總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定。運(yùn)用Bradford原理，使用蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒（生工生物）進(jìn)行蛋白測(cè)定。

1.5 木質(zhì)素酶活力測(cè)定

1.5.1 漆酶 用ABTS（Sigma）的氧化來(lái)表示漆酶的活性。其1.0 mL反應(yīng)體系為：900滋L 0.5 mmol·L-12, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）和0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液（pH 5.0），加入100滋L粗酶液，啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)3 min內(nèi)420 nm處吸光度的變化［13］。以1 min轉(zhuǎn)化1滋mol ABTS所需的酶量來(lái)表示1個(gè)酶活力單位（滋mol·min-1）。

1.5.2 錳過(guò)氧化物酶 在錳和過(guò)氧化氫存在下氧化2,6-二甲氧基苯酚（DMP，Sigma）來(lái)表示錳過(guò)氧化物酶的活性。其1.0 mL反應(yīng)體系中含100.0 mmol·L-1酒石酸鈉緩沖液（pH 4.5），1.0 mmol·L-1DMP，1.0 mmol·L-1硫酸錳和0.1 mmol·L-1過(guò)氧化氫，在加入100滋L粗酶液后啟動(dòng)反應(yīng)體系，測(cè)定3 min內(nèi)469 nm處吸光度的變化［14］。以1 min轉(zhuǎn)化1滋mol DMP所需的酶量來(lái)表示1個(gè)酶活力單位（滋mol·min-1）。

1.5.3 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶 在過(guò)氧化氫存在下氧化藜蘆醇（Sigma）來(lái)表示木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的活性。其1.0 mL反應(yīng)體系中含10.0 mmol·L-1酒石酸鈉緩沖液 （pH 3.0），2.0 mmol·L-1藜蘆醇和0.4 mmol·L-1過(guò)氧化氫，在加入100滋L粗酶液后啟動(dòng)反應(yīng)體系，測(cè)定3 min內(nèi)310 nm處吸光度的變化［14］。以1 min轉(zhuǎn)化1滋mol藜蘆醇所需的酶量來(lái)表示1個(gè)酶活力單位（滋mol·min-1）。

1.6 纖維素酶活力測(cè)定

1.6.1 內(nèi)切葡聚糖酶 以羧甲基纖維素（CMC，Sigma）為底物，反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖來(lái)表示內(nèi)切葡聚糖酶的活性。在50.0 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）配制成的900滋L 1%（w·v-1）羥甲基纖維素（CMC）溶液中加入100滋L粗酶液，于32℃反應(yīng)30 min，然后在CMC溶液中加入等體積（1.0 mL）的3,5-二硝基水楊酸（DNS試劑），于100℃水浴10 min，再于4℃下保持15 min，最后恢復(fù)室溫，測(cè)定540 nm下的吸光度［15］。用1 min所產(chǎn)生1滋g還原糖的量來(lái)表示1個(gè)酶活力單位（滋g·min-1）。

1.6.2 外切葡聚糖酶 以4-nitrophenyl β-D-cellobioside（pNPC,Sigma）氧化成對(duì)硝基酚的能力來(lái)表示外切葡聚糖酶的活性。在900滋L含10.0 mmol·L-1pNPC和100.0 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）中加入100 滋L粗酶液，于50℃水浴反應(yīng)15 min，測(cè)定415 nm處的吸光度［16-17］。用1 min產(chǎn)生1滋mol對(duì)硝基酚來(lái)表示1個(gè)酶活力單位（滋mol·min-1）。

1.6.3 β-葡萄糖苷酶 以4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside（pNPG,Sigma）氧化成對(duì)硝基酚的能力來(lái)表示β-葡萄糖苷酶的活性。在900滋L含10.0 mmol·L-1pNPG和100.0 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）中加入100滋L粗酶液，于50℃水浴反應(yīng)15 min，測(cè)定415 nm處的吸光度［17］。以1 min產(chǎn)生1滋mol對(duì)硝基酚所需的酶量來(lái)表示1個(gè)酶活力單位（滋mol·min-1）。

1.7 木材侵染能力測(cè)定

在無(wú)菌條件下，將上述分離得到的5種木腐真菌分別接種到9 cm的PDA平板培養(yǎng)皿中，接種后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，使菌種長(zhǎng)滿平板或基本長(zhǎng)滿平板。

從臨安市馬溪木材廠取得未經(jīng)處理的柚木、橡木、菠蘿格、杉木、花旗松和馬尾松等的邊材加工成18 mm×18 mm×3 mm大小樣品，并給每塊木材樣品編號(hào)，放入溫度為103℃烘箱中烘干6 h，每塊木材樣品用電子天平稱量（精確到0.001 g）。然后將木材樣品包好在高壓滅菌鍋中滅菌（120℃，20 min）。在無(wú)菌條件下，將木塊置于長(zhǎng)滿菌絲的平板培養(yǎng)基內(nèi)，放木材樣品1塊·培養(yǎng)基-1，重復(fù)3次·樣品-1，然后將培養(yǎng)皿放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中，12周后，取出附帶菌絲體的木塊，除去表面的菌絲，放入103℃烘箱中烘干6 h，稱量。計(jì)算木材樣品受菌侵染后的質(zhì)量損失百分率，以百分?jǐn)?shù)計(jì)算表示。計(jì)算公式為：試樣質(zhì)量損失百分率（%）=（W1-W2）÷W1×100%。其中：W1為木塊樣品試驗(yàn)前的干質(zhì)量，W2為木塊樣品試驗(yàn)后的干質(zhì)量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

木質(zhì)纖維素酶在5種木腐真菌中的活性差異以及5種木腐真菌對(duì)木材侵染能力的差異運(yùn)用方差進(jìn)行分析（Newman-Keuls），其顯著水平α=0.05。數(shù)據(jù)分析所使用的分析軟件為SPSS 16.0（SPSS Inc）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

2.1.1 MX1菌株 MX1菌株腐生在楊樹(shù)儲(chǔ)木上，圖1A為采集地儲(chǔ)木上菌株子實(shí)體（箭頭所指），易與物剝離，灰白色，平伏，貼生。圖1B為該菌從子實(shí)體上分離純化后，在25℃下培養(yǎng)8 d的菌落，菌絲起初為白色，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，擴(kuò)散性色素積累，變?yōu)榧t色至暗紅色。顯微結(jié)構(gòu)觀察到2種分生孢子，大孢子（圖1C實(shí)心箭頭）和小孢子（圖1C空心箭頭）。大孢子細(xì)長(zhǎng)，鐮刀形，有3個(gè)隔，大小約為20.0 μm×1.5~2.5 μm；小孢子形態(tài)多樣，有卵形、腎形、圓柱形，大小約為2.5~5.0 μm×1.0~1.5 μm。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MX1菌株ITS序列和26S D1/D2區(qū)域序列長(zhǎng)度分別為544 bp和606 bp（GenBank登錄號(hào)分別為KF513162和KF513167），經(jīng)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）快速局域序列對(duì)位排列算法（BLAST）比對(duì)后發(fā)現(xiàn)MX1菌株ITS序列與已知尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum ITS序列（GenBank登錄號(hào)JF776163）完全一致；MX1菌株D1/D2序列與已知尖孢鐮刀菌D1/D2序列（GenBank登錄號(hào)KF181210）完全一致。尖孢鐮刀菌可以產(chǎn)生大孢子、小孢子和厚壁孢子等3種無(wú)性分生孢子，大孢子為兩頭尖，大小20~30 μm的鐮刀狀，小孢子為橢圓形，而厚壁孢子一般在黑暗或逆境中才會(huì)出現(xiàn)［18］。綜合MX1菌株的子實(shí)體、分生孢子種類和形態(tài)、ITS序列和26S D1/D2序列比對(duì)結(jié)果，可以確定MX1菌株為尖孢鐮刀菌。

圖1 尖孢鐮刀菌（MX1）形態(tài)學(xué)特征Figure 1 Morphological characteristics of Fusarium oxysporum

圖2 毛栓孔菌（MX2）形態(tài)學(xué)特征Figure 2 Morphological characteristics of Trametes hirsuta

2.1.2 MX2菌株 MX2號(hào)菌株腐生在泡桐木原木上，圖2A為采集地原木上菌株子實(shí)體（箭頭所指），無(wú)柄蓋形，菌蓋扁平，表面白色中帶淺棕黃色，半圓形或扇形，被厚絨毛，有明顯同心環(huán)帶。目前，木腐真菌的鑒定大多以子實(shí)體形態(tài)來(lái)進(jìn)行判定，該菌株的子實(shí)體形態(tài)與毛栓孔菌子實(shí)體形態(tài)極為相似［19］。圖2B為該菌在25℃下培養(yǎng)8 d的菌落，菌絲白色，不產(chǎn)生擴(kuò)散性色素，有嚴(yán)重腐爛臭味。隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，菌絲越來(lái)越茂盛，越長(zhǎng)越厚，幾十天之后，可形成團(tuán)塊狀實(shí)心菌絲球，并且菌絲體易從培養(yǎng)基上撕落。顯微結(jié)構(gòu)觀察到2種菌絲形態(tài)，圖2C中菌絲不分枝，細(xì)長(zhǎng)，圖2D中菌絲具有鎖狀聯(lián)合（圖2D箭頭）。從顯微結(jié)構(gòu)的2種菌絲形態(tài)，可以推測(cè)MX4號(hào)是擔(dān)子菌門(mén)的真菌。圖2C中不分枝的菌絲為骨架菌絲，圖2D中具有鎖狀聯(lián)合的菌絲為生殖菌絲。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MX2菌株ITS序列和26S D1/D2區(qū)域序列長(zhǎng)度分別為628 bp和645 bp（GenBank登錄號(hào)分別為KF513163和KF513168），經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)MX2菌株ITS序列與已知毛栓孔菌Trametes hirsuta ITS序列（GenBank登錄號(hào)AB733170）相似度達(dá)到99%；MX2菌株D1/D2序列與已知毛栓孔菌D1/D2序列（GenBank登錄號(hào)AB733343）完全一致。綜合MX2菌株子實(shí)體、菌落形態(tài)、菌絲顯微結(jié)構(gòu)、ITS序列和26S D1/D2序列比對(duì)結(jié)果，可以確定MX2菌株為毛栓孔菌。

2.1.3 MX3菌株 MX3號(hào)菌株腐生在松木上，圖3A為采集地原木上該菌株子實(shí)體（圖3A箭頭所指的白色物質(zhì)），白色，平伏，貼生。圖3B為該菌在25℃下培養(yǎng)8 d的菌落，菌絲白色，生長(zhǎng)茂盛，無(wú)腐爛臭味，培養(yǎng)10 d左右，培養(yǎng)基底部可見(jiàn)黃色或紅紫色擴(kuò)散性色素。顯微結(jié)構(gòu)觀察到2種孢子，分生孢子和厚壁孢子。分生孢子卵形至橢圓形（圖3C實(shí)心箭頭），大小為2.0~5.0 μm×0.5~1.5 μm，并且產(chǎn)孢量大；厚壁孢子卵圓形（圖3C空心箭頭），有分隔，大小為8.0~9.0 μm×1.5~4.0 μm。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MX3菌株 ITS序列和 26S D1/D2區(qū)域序列長(zhǎng)度分別為 558 bp和 606 bp（GenBank登錄號(hào)分別為KF513164和KF513169），經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)MX3菌株ITS序列與已知層生鐮刀菌Fusarium proliferatum ITS序列（GenBank登錄號(hào)HQ380763）完全一致；MX3菌株D1/D2序列與已知層生鐮刀菌D1/D2序列（GenBank登錄號(hào)HQ382533）完全一致。該菌株菌落中心紅紫色色素以及小分生孢子形態(tài)與層生鐮刀菌的菌落及小孢子描述相似［20］。綜合MX3菌株子實(shí)體、菌落形態(tài)、分生孢子種類和形態(tài)、ITS序列和26S D1/D2序列比對(duì)結(jié)果，可以確定MX3菌株為層生鐮刀菌。

圖3 層生鐮刀菌（MX3）形態(tài)學(xué)特征Figure 3 Morphological characteristics of Fusarium proliferatum

圖4 裂褶菌（MX4）形態(tài)學(xué)特征Figure 4 Morphological characteristics of Schizophyllum commune

2.1.4 MX4菌株 MX4菌株腐生在楊樹(shù)原木上。圖4A為采集地原木上菌株子實(shí)體（箭頭所指），菌蓋扇形，菌肉白色，此形態(tài)與裂褶菌子實(shí)體相似［19］。圖4B為該菌在25℃下培養(yǎng)8 d的菌落，菌絲白色，生長(zhǎng)茂盛，不易衰老，有腐爛臭味。隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，菌絲不斷連接與分化，2~3個(gè)月后能在培養(yǎng)基上形成黃色、表面裂褶的蘑菇。該菌菌絲顯微結(jié)構(gòu)具有鎖狀聯(lián)合（圖4C實(shí)心箭頭），且沿著菌絲兩側(cè)長(zhǎng)有針狀體（圖4C空心箭頭）。從顯微結(jié)構(gòu)的鎖狀聯(lián)合特征，可以推測(cè)MX4號(hào)是擔(dān)子菌門(mén)的真菌，圖4C中具有鎖狀聯(lián)合的菌絲為生殖菌絲。生殖菌絲的鎖狀聯(lián)合以及針狀突是裂褶菌菌絲的典型結(jié)構(gòu)［21］，該菌株菌絲均具有這2種形態(tài)，可以初步判定其為裂褶菌。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MX4菌株ITS序列和26S D1/D2區(qū)域序列長(zhǎng)度分別為636 bp和645 bp（GenBank登錄號(hào)分別為KF513165和KF513170），經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)MX4菌株ITS序列與已知裂褶菌Schizophyllum commune ITS序列（GenBank登錄號(hào)JX848644）完全一致；MX4菌株D1/D2序列與已知裂褶菌 D1/D2序列（GenBank登錄號(hào)AB428351）完全一致。綜合MX4菌株子實(shí)體、菌落形態(tài)、菌絲顯微結(jié)構(gòu)、ITS序列和26S D1/D2序列比對(duì)結(jié)果，可以確定MX4菌株為裂褶菌。

2.1.5 MX5菌株 MX5菌株腐生在松木上。圖5A為采集地原木上該菌株子實(shí)體（箭頭所指），菌蓋扇形扁平，菌肉紅色，此形態(tài)與血紅密孔菌子實(shí)體形態(tài)極為相近［19］。圖5B為該菌在25℃培養(yǎng)8 d的菌落，將培養(yǎng)基上白色物質(zhì)刮下，在顯微結(jié)構(gòu)下觀察，發(fā)現(xiàn)只有大量孢子，并沒(méi)有菌絲。該菌株菌絲分布在培養(yǎng)基內(nèi)部，培養(yǎng)基表面無(wú)菌絲。圖5C為分生孢子，圓柱形或橢圓形，大小為1.5~2.5 μm×0.5~1.0 μm。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MX5菌株ITS序列和26S D1/D2區(qū)域序列長(zhǎng)度分別為636 bp和645 bp（GenBank登錄號(hào)分別為KF513166和KF513171），經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)MX5菌株ITS序列與已知血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus ITS序列（GenBank登錄號(hào)HQ891297）完全一致；MX5菌株D1/D2序列與已知血紅密孔菌 D1/D2序列（GenBank登錄號(hào)HM595619）完全一致。綜合MX5菌株子實(shí)體、菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)、ITS序列和26S D1/D2序列比對(duì)結(jié)果，可以確定MX5菌株為血紅密孔菌。

圖5 血紅密孔菌（MX5）形態(tài)學(xué)特征Figure 5 Morphological characteristics of Pycnoporus sanguineus

2.2 木腐真菌木質(zhì)纖維素酶活性

由表1可以看出：5種木腐真菌木質(zhì)纖維素酶活性存在較大差異，其中，木質(zhì)素酶活性普遍高于纖維素酶活性。漆酶和錳過(guò)氧化物酶在5種真菌中均有表達(dá)，其中，漆酶在尖孢鐮刀菌和層生鐮刀菌中活性最高，分別達(dá)到501.19和295.73 μmol·min-1·g-1；錳過(guò)氧化物酶在層生鐮刀菌和血紅密孔菌中活性最高，分別達(dá)到247.11和241.39 μmol·min-1·g-1；木質(zhì)素過(guò)氧化物酶僅在裂褶菌中有少量活性，而在其余4種真菌均未檢測(cè)到活性（表1）。內(nèi)切葡聚糖酶分別在毛栓孔菌、層生鐮刀菌和裂褶菌中檢測(cè)到活性，其中在毛栓孔菌中活性最高，達(dá)到100.38 μg·min-1·g-1；外切葡聚糖酶僅在毛栓孔菌和層生鐮刀菌中有較低活性，而在其余3種真菌中未檢測(cè)到活性；β-葡萄糖苷酶除了在尖孢鐮刀菌中未檢測(cè)到活性外，其余四種真菌均有活性（表1）?？傮w而言，毛栓孔菌、層生鐮刀菌、裂褶菌和血紅密孔菌均表現(xiàn)出木質(zhì)素酶和纖維素酶活性，而尖孢鐮刀菌僅呈現(xiàn)出木質(zhì)素酶活性。

2.3 木材侵染能力分析

從木材樣品真菌侵染前后質(zhì)量損失率可以進(jìn)一步得出（表2），毛栓孔菌對(duì)6種木材造成的質(zhì)量損失均顯著高于其他4種木腐真菌，其中除了對(duì)菠蘿格造成2.21%質(zhì)量損失外，對(duì)其他5種木材樣品均造成20.00%以上的質(zhì)量損失；血紅密孔菌對(duì)菠蘿格的侵染能力類似于毛栓孔菌，對(duì)橡木和杉木的侵染能力僅次于毛栓孔菌，但顯著強(qiáng)于其他3種真菌，造成的質(zhì)量損失率分別達(dá)到41.37%和14.08%；尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌和裂褶菌對(duì)6種木材樣品的侵染能力顯著弱于毛栓孔菌，其造成的木材質(zhì)量損失率普遍低于3%。

表1 PDA培養(yǎng)14 d后5種木腐真菌木質(zhì)纖維素酶活性Table 1 Lignocellulolytic activities of Fusarium oxysporum,Trametes hirsute,Fusarium proliferatum,Schizophyllum commune and Pycnoporus sanguineus on PDA after fourteen days

表2 木腐真菌侵染12周后不同木材的質(zhì)量損失率Table 2 Weight losses of Tectona grandis,Quercus mongolica,Intsia biujga,Cunninghamia lanceolata,Pseudotsuga menziesii and Pinus massoniana after twelve weeks of wood-rotting fungus exposure

3 討論

通過(guò)真菌子實(shí)體、菌落、菌絲體和分生孢子形態(tài)，結(jié)合ITS及26s rDNA D1/D2序列，本研究共鑒定出5種真菌，其中3種屬于擔(dān)子菌門(mén)非褶菌目，分別是毛栓孔菌、裂褶菌和血紅密孔菌；2種屬于子囊菌門(mén)鐮刀菌屬，分別是尖孢鐮刀菌和層生鐮刀菌。毛栓孔菌是最常見(jiàn)的一種木材腐朽菌，能腐生在闊葉樹(shù)和針葉樹(shù)原木上，造成木材白色腐朽［1］。裂褶菌是分布較廣的一種木材腐朽菌，能腐生在闊葉樹(shù)儲(chǔ)木上，造成木材白色腐朽［19］。血紅密孔菌能腐生在多種闊葉樹(shù)儲(chǔ)木上，造成木材白色腐朽［6］。層生鐮刀菌是糧食作物中常見(jiàn)的病原菌（特別是玉米Zea mays），能產(chǎn)生一系列的真菌毒素，影響糧食生產(chǎn)與安全［22］，但也有研究表明：該菌種是引起中國(guó)楊樹(shù)Populus濕心材的一種病原真菌［23］，其具備木質(zhì)素降解能力［24］。尖孢鐮刀菌廣泛存在于土壤中，可侵染植物的一種兼性寄生真菌，能對(duì)許多寄主植物造成病害［25］。本研究中的尖孢鐮刀菌雖是從MX1菌株分離所得，但從子實(shí)體外觀形態(tài)推測(cè)，該菌應(yīng)該只是與子實(shí)體菌株共生的一種真菌。

毛栓孔菌普遍用于木質(zhì)素的降解研究，其體內(nèi)具備高活性的漆酶，錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶［26］，但也有研究表明，毛栓孔菌體內(nèi)具備一定的纖維素酶［27］。本研究中分離到的毛栓孔菌具備木質(zhì)素和纖維素降解相關(guān)的酶（除了木質(zhì)素過(guò)氧化物酶），雖然該菌木質(zhì)纖維素酶活性在5種真菌中不突出，但其對(duì)不同木材的侵染腐朽能力顯著強(qiáng)于其余4種真菌，說(shuō)明該菌適應(yīng)能力強(qiáng)，能腐朽不同化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)的木材，能在多種木材上生長(zhǎng)。

血紅密孔菌是一種被廣泛用于產(chǎn)漆酶及其應(yīng)用研究的真菌［28-30］。本研究中分離到的血紅密孔菌也同樣表現(xiàn)出較高的漆酶活性，同時(shí)也檢測(cè)到錳過(guò)氧化物酶和β-葡萄糖苷酶的活性。血紅密孔菌對(duì)不同木材具備不同的白色腐朽能力。Pointing等［31］通過(guò)12周的木材腐朽實(shí)驗(yàn)表明，血紅密孔菌能分別造成山毛櫸Fagus sylvatica和樟子松Pinus sylvestris 34.9%和19.1%的質(zhì)量損失。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)血紅密孔菌對(duì)不同木材表現(xiàn)出較強(qiáng)的選擇性侵染腐朽能力，其中對(duì)橡木的侵染能力最強(qiáng)，造成質(zhì)量損失率達(dá)到41.37%，而對(duì)柚木的侵染能力較弱，只造成2.20%的質(zhì)量損失。

裂褶菌作為一種白腐真菌，具備降解木材細(xì)胞壁中木質(zhì)纖維素的能力［32］。Asgher等［33］研究發(fā)現(xiàn)，S. commune IBL-06具備木質(zhì)素降解所需的漆酶、錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶，其中錳過(guò)氧化物酶活性最高，其次是漆酶。本研究中，錳過(guò)氧化物酶、漆酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶在裂褶菌體內(nèi)表現(xiàn)出相似的活性。然而，通過(guò)基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，裂褶菌雖然具有豐富的纖維素酶基因和漆酶編碼基因，但不存在錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶編碼基因，木質(zhì)素的降解可能主要依靠漆酶或纖維二糖脫氫酶的作用［34］。雖然裂褶菌具有降解木質(zhì)纖維素相關(guān)的酶，但其活性普遍不高，相應(yīng)地，其對(duì)木材的侵染腐朽能力也不強(qiáng)，造成木材質(zhì)量損失率為0.61%~2.50%。

層生鐮刀菌因能在玉米中分泌伏馬菌素而成名［35］，但對(duì)木材腐爛能力的研究則較少。本研究中，層生鐮刀菌雖然具備較高活性的木質(zhì)纖維素酶活性，但其對(duì)不同木材的侵染能力普遍較弱，造成木材質(zhì)量損失率＜2.00%。尖孢鐮刀菌雖然是一種傳統(tǒng)的植物病原物，但其體內(nèi)具有木質(zhì)素降解的相關(guān)酶［36］。本研究也表明，尖孢鐮刀菌菌絲體具有漆酶和錳過(guò)氧化物酶的活性，但不存在纖維素酶活性，其對(duì)木材的侵染腐朽能力也不強(qiáng)。

通常認(rèn)為，木質(zhì)纖維素酶活性高的菌株，相應(yīng)的降解木質(zhì)素和纖維素的能力也較強(qiáng)。但從本研究木腐真菌的木質(zhì)纖維素酶活力及其木材腐朽能力的研究中可以發(fā)現(xiàn)，木腐真菌表現(xiàn)出的酶活性和對(duì)木材的降解能力不能完全對(duì)應(yīng)，較高的木質(zhì)纖維素酶活力并不代表其具有較強(qiáng)的木材腐朽能力，如層生鐮刀菌；較低的木質(zhì)纖維素酶活力也不意味著其木材腐朽能力較弱，如毛栓孔菌。可以看出，真菌木質(zhì)纖維素酶的活性和其木材腐朽能力關(guān)系復(fù)雜，真菌對(duì)木材的腐朽是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不能僅憑借某些酶的活性而斷言其腐朽能力。

4 結(jié)論

木腐真菌既是自然界中木質(zhì)纖維素的主要分解者，也是影響木材使用壽命的主要因素。本研究通過(guò)對(duì)木腐真菌鑒定及其體內(nèi)木質(zhì)纖維素酶系研究，分析其對(duì)6種木材的侵染能力，得出如下結(jié)論：①利用真菌形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)方法鑒定出5種木腐真菌，分別為尖孢鐮刀菌、毛栓孔菌、層生鐮刀菌、裂褶菌和血紅密孔菌。②5種木腐真菌體內(nèi)表現(xiàn)出不同的木質(zhì)纖維素酶種類和活性，其中層生鐮刀菌、毛栓孔菌、裂褶菌和血紅密孔菌具備1種或多種木質(zhì)素酶和纖維素酶，而尖孢鐮刀菌僅能分泌木質(zhì)素酶。③毛栓孔菌對(duì)木材的侵染能力最強(qiáng)，其造成不同木材的質(zhì)量損失率均在20.00%以上（除菠蘿格2.21%外），血紅密孔菌對(duì)不同木材的侵染能力有所差異，其中能造成較高的41.37%橡木質(zhì)量損失率，也能造成較低的2.20%柚木質(zhì)量損失率，其余3種真菌對(duì)不同木材的侵染能力均不強(qiáng)，造成的質(zhì)量損失率菌都低于3.00%。④木腐真菌木質(zhì)纖維素酶與其木材侵染能力不存在正相關(guān)，即具有較高或較為豐富木質(zhì)纖維素酶的木腐真菌不能認(rèn)定其具有較強(qiáng)的木材侵染能力，反之亦然。

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Identification of wood-rotting fungi and their decay capability in six wood species

LUO Jingyi，F(xiàn)U Weirui，PAN Chengyuan
（School of Agricultural and Food Science，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

Wood-rotting fungi，one of the lignocellulose decomposers in nature，play an important role in the material cycle of the ecosystem.In order to clarify the relationship between wood decay capability of fungi and their lignocellulases activity，five kinds of wood-rotting fungi were identified in this study （namely Fusarium oxysporum,Trametes hirsuta,Fusarium proliferatum,Schizophyllum commune,and Pycnoporus sanguineus），based on morphological characteristics of sporophore，colony，mycelium，and conidium，and combined with sequences of internal transcribed spacer （ITS）and 26S rDNA D1/D2.Also，lignases and cellulases activities were determined from the wood-rotting fungi.Biodegradation capability of the fungi to six different species of wood,including oak （Quercus mongolica）,teak （Tectona grandis）,merbau （Intsia biujga）,Chinese fir （Cunninghamia lanceolata）,Douglas fir （Pseudotsuga menziesii）and masson pine （Pinus massoniana）,was evaluated through wood mass losses of pre-and post-treatments.Results showed that for all five species of fungi,laccase and manganese peroxidase exhibited higher activities than cellulases.After 12 weeks of the decay experiment,T.hirsuta caused the most decay with oak （mass loss of 69.16%）.F.oxysporum,F. proliferatum,and S.commune caused less than 3.00%mass loss with all six species of wood;whereas P.sanguineus caused 41.37%mass loss with oak but only 2.20%mass loss with teak.When comparing wood decay capability of fungi and lignocellulases activity，higher lignases and cellulases activity of the fungus did not mean it had higher decay capability on the wood.［Ch，5 fig.2 tab.36 ref.］

wood science and technology；wood-rotting fungi；identification；lignases；cellulases；wood decay

S782.33

A

2095-0756（2015）01-0001-10

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)，2015，32（1）：1-10

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.01.001

2014-02-17；

2014-05-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31301923）；浙江農(nóng)林大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金資助項(xiàng)目（201201012）

駱靜怡，從事木腐真菌研究。E-mail:123973358@qq.com。通信作者：潘程遠(yuǎn)，副教授，博士，從事木材抗蟲(chóng)防腐研究。E-mail:cypan@zafu.edu.cn