侯傳明，鄭雅文，王正加，徐英武

山核桃MADS-like基因的克隆與分析

侯傳明，鄭雅文，王正加，徐英武

（浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

MADS-box基因在植物花發(fā)育的整個階段起到了極為關鍵的作用。根據(jù)山核桃 Carya cathayensis雌花芽454測序得到的基因片段，采用cDNA末端快速擴增（RACE）技術，獲得了1條CcMADS-like基因。序列分析結果表明：CcMADS-like開放閱讀框（ORF）長度為609 bp，編碼202個氨基酸，具有典型的MADS-box結構域，包括高度保守的MADS盒和K區(qū)以及I區(qū)、C區(qū)。CcMADS-like與擬南芥Arabidopsis thaliana，金魚草Antirrhinum majus，美洲黑楊Populus deltoides，歐洲大葉楊Populus trichocarpa等的同源基因所編碼的蛋白質同源性分別達到48%，65%，69%，71%。山核桃不同組織實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）結果表明：CcMADS-like基因在花芽中表達量遠遠高于其他組織，暗示該基因極有可能參與山核桃成花發(fā)育。酵母單雜交實驗表明，CcMADS-like蛋白具有轉錄激活活性。圖5表1參25

經濟林學；花發(fā)育；山核桃；MADS-box；基因克??；qRT-PCR；酵母單雜交實驗

開花是高等植物由營養(yǎng)生長向生殖生長的一個重要生理轉變過程，既受外界環(huán)境因素的影響，又受內在基因的調控，其中 MADS-box基因在花的發(fā)育過程中起著重要的作用。MADS由釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的MCM1，擬南芥Arabidopsis thaliana的AGAMOUS，金魚草Antirrhinum majus 的DEFICIENS和人類Homo sapiens的SRF等4種蛋白因子的首寫字母構成［1］。MADS基因有2個主要譜系：TypeⅠ型和TypeⅡ型。大多數(shù)植物序列和動物的MEF2型基因共同形成Ⅱ型譜系［2］。植物中的MADS-box基因具有相似的內含子和外顯子結構，MADS轉錄因子主要由MADS盒、K盒、I區(qū)、C末端等4個部分組成［3-4］。MADS-box基因所編碼的蛋白為MADS-box轉錄因子，以二聚體化的形式通過其保守結構域與特定的DNA序列相結合來調控下游基因的表達［5-6］。MADS基因幾乎參與植物成花的所有途徑［7］，形成復雜的網絡控制植物成花，其調控成花機制有著名的ABC模型［8-9］，隨著矮牽牛 Petunia hybrida FBP7和FBP11基因［10］和擬南芥SEP3基因［11］的克隆鑒定，最終得到植物花形態(tài)建成的新模型：四分子模型［12］。該模型認為，同源或異源MADS轉錄因子形成四聚蛋白調控復合體，四聚體結合在目標基因啟動子區(qū)調節(jié)基因開閉，進而調控花發(fā)育［13］。構成四聚體的2個二聚體單位（同源二聚體或者異源二聚體）特異地結合在DNA相鄰的CArG-box（5′-CC［A/T］6GG-3′）上［14］，通過C末端結合形成四聚體，致使DNA分子彎曲靠近，然后通過激活或抑制靶基因表達進而調控花器官發(fā)育。山核桃Carya cathayensis，雌雄同株，雌雄花器官發(fā)生發(fā)育的時間和部位不同，具有單性花成花時空表達特異性［15-16］。本研究在山核桃雌花芽轉錄組454測序鑒定出114個可能的成花基因基礎上［16］，首次克隆得到了山核桃相關MADS基因，并進行基本生物信息學分析，采用熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）研究它在不同組織的表達差異，采用酵母單雜交方法驗證其轉錄因子的功能，為進一步闡明該基因在山核桃成花的過程和機制奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗所用材料為浙江省臨安市板橋鎮(zhèn)羅塘村，海拔50~200 m的西南—西北向陽山坡上正常生長發(fā)育的野生山核桃植株。山核桃雌花芽從3月初開始分化到4月完成授粉；雄花芽在5-6月發(fā)育，然后進入休眠期［17］。故分別采集3-4月的雌花芽和5-6月的雄花芽以及同期根、莖、葉、營養(yǎng)芽，所取樣品馬上用液氮保存，回實驗室放置-80℃冰箱備用。

1.2 RNA提取檢測和cDNA合成

將采集的山核桃雌雄花芽樣品混合，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨+核糖核酸（RNA）裂解液（CTAB+Trizol）法提取總核糖核酸（RNA），以10.0 g·kg-1瓊脂糖凝膠對各樣品的RNA進行電泳和NanoDrop-1000測吸光度值相結合，檢測樣品RNA的質量。根據(jù)cDNA Synthesis Kit（Takara）說明書以已檢測過的總RNA為模板合成cDNA的第1條鏈，進而合成cDNA。

1.3 CcMADS-like基因克隆

根據(jù)山核桃3月初到7月初不同階段的雌花芽混合樣454測序［16］所獲得的基因片段，在美國國家生物技術信息中心（NCBI）序列同源比對后設計cDNA末端快速擴增技術（RACE）引物，3′RACE第1輪引物為3GSP1，第2輪引物為3GSP2；5′RACE第1輪引物為5GSP1，第2輪引物為5GSP2（表1）。依照5′-Full RACE Kit with TAP和3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase（Takara）分別進行3′RACE和5′RACE。根據(jù)RACE結果設計開放閱讀框（ORF）引物F1和R1（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以山核桃雌雄花芽混合樣cDNA為模板，聚合酶鏈式反應（PCR）擴增目的條帶；10.0 g·kg-1瓊脂糖凝膠電泳，DNA Gel Extraction Kit（生工生物）回收目的片段，連接到pMD-19T Sample Vector （TaKaRa）上，42℃熱激法轉化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α，藍白斑篩選，挑取陽性單克隆，搖菌過夜，Plasmid Mini-Preps Kit（生工生物）提取質粒，酶切鑒定的陽性樣品送到中國上海生工生物工程服務有限公司測序。

1.4 CcMADS-like基因序列分析

測序結果在NCBI網站上進行BLAST比對，用DNAMAN軟件進行序列氨基酸編輯和多序列比對，結合MEGA5.2軟件采用Neighbor-Joining（NJ）分析方法構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 qRT-PCR分析

分別以山核桃根、莖、葉、營養(yǎng)芽、混合花芽提取的總RNA反轉錄的cDNA為模板，應用ABI-7500定量PCR（real-time PCR）儀對CcMADS-like在根、莖、葉、營養(yǎng)芽、花芽等不同組織的表達進行定量分析，每種組織模板進行3次生物學重復實驗。所用引物為RT1和RT2。以本課題組設計的山核桃Actin基因為內參，內參引物序列為：Actin1和Actin2（表1）。

1.6 CcMADS-like轉錄激活活性驗證

設計引物（表1），PCR擴增獲得CcMADS-like的全長ORF，TINY2［18］CDS全長。BamHⅠ/ EcoRⅠ酶切凝膠電泳后回收，連接入克隆入酵母表達載體pGBKT7（GAL4-BD）（Clotech），熱激轉化入大腸埃希菌DH5α中，陽性單克隆經雙酶切及測序確定序列正確性。以LiAc高效轉化法制備酵母感受態(tài)AH109，采用PEG3350/DMSO法將pGBKT7-X轉化入現(xiàn)制感受態(tài)。梯度稀釋后涂布于-Trp/SD單缺培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2~3 d至菌落d=2~3 mm，挑取陽性單克隆反復冷熱處理破壁后，進行菌落PCR檢測。其中pGBKT7為陰性對照，pGBKT7-TINY2為陽性對照。檢測得到的陽性單克隆點滴法5.0 μL于含有X-α-Gal（clotech）的SD/-Trp培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)觀察。

表1 實驗所用引物Table 1 Primer sequences used in experiment

2 結果與分析

2.1 CcMADS-like基因克隆和序列分析

根據(jù)山核桃花芽454測序得到的基因片段設計RACE引物，以混合花芽的cDNA為模板3′RACE擴增得到了650 bp的片段，5′RACE擴增得到了350 bp的片段，將5′RACE和3′RACE獲得的序列進行拼接，結果表明：該基因ORF長度為609 bp，含有TAA終止密碼子，編碼202個氨基酸（圖1）。經過 Blastp比對分析表明，該蛋白具有典型的MADS-box結構域，M區(qū)與MEF2-like蛋白高度一致，以此確定該基因屬于TypeⅡ MADS家族基因,是MIKC型MADS蛋白（圖1）。多序列比對發(fā)現(xiàn)M區(qū)（編碼58個氨基酸）具有高度的保守性，K區(qū)（編碼87個氨基酸）也有較高的保守性（圖2），與歐洲大葉楊Populus trichocarpa XP_002321711.1，美洲黑楊Populus deltoids ABV23568.1， 金魚 草 Antirrhinum majus CAC44080.1， 擬南芥 Arabidopsis thaliana NP_182090.1同源蛋白的一致性（identity）分別為71%，69%，65%，48%。在NCBI查找已經鑒定的其他物種同源序列，經ClustalX比對后，用MEGA5.2構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結果顯示：CcMADS-like與歐洲大葉楊Populus trichocarpa XP_002321711.1和美洲黑楊Populus deltoids ABV23568.1關系最近，與芥菜Brassica juncea AFM77893.1和歐洲油菜Brassica napus AFH41826.1關系較遠。

圖1 CcMADS-like序列和功能結構分析Figure 1 Nucleotide sequence and function structural domain analysis of CcMADS-like

圖2 CcMADS-like和其他物種MADS蛋白氨基酸序列間的同源性比對Figure 2 Alignment of amino acid sequence of MADS genes from different plants

2.2 CcMADS-like在不同組織中的表達分析

CcMADS-like不同組織qRT-PCR結果顯示:CcMADS-like在根和莖中幾乎沒有檢測到表達；在葉、營養(yǎng)芽、花芽中均有表達，但表達量存在較大差異；在花芽中的表達量遠遠大于其他組織（圖4）。

2.3 CcMADS-like轉錄激活功能分析

轉化有重組質粒pGBKT7-TINY2，pGBKT7-CcMADS-like，pGBKT7的酵母AH109在單缺板上生長良好，單克隆的菌落PCR檢測也表明重組質粒成功轉化入酵母菌株（圖5）。在含有X-α-Gal的選擇培養(yǎng)基上，3種轉化菌株均有良好單菌落生長；pGBKT7-CcMADS-like和pGBKT7-TINY的酵母菌落呈明顯藍色；pGBKT7的酵母菌落沒有藍色表現(xiàn)（圖5）。這說明CcMADS-like的確具有轉錄激活活性。

圖3 基于MADS基因氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹分析Figure 3 Phylogenetic analysis based on the amino acid sequence of MADS-box genes

圖4 CcMADS-like在不同組織中的表達分析Figure 4 Relative expression of CcMADS-like in the root,stem, leaf,vegetative budsand floralbuds ofCarya cathayensis

圖5 CcMADS-like轉錄激活功能分析Figure 5 PCR test and yeast one-hybrid assay of CcMADS-like

3 討論

MADS-box基因家族廣泛參與植物成花的各種途徑和不同時期，是植物成花的主要內因。其編碼的蛋白，即MADS轉錄因子，以二聚化的形式通過其保守結構域與特定的DNA序列相結合來調控基因的表達。作為轉錄因子，MADS蛋白的結構具備轉錄因子的普遍特性，即含有DNA結合結構域和激活結構域。典型的MIKC型MADS-box主要由MADS盒、K盒、I區(qū)、C末端等4個部分組成。MADS盒是DNA結合單元［19］；K盒是植物MADS轉錄因子的特征序列，也是發(fā)生二聚體化的結構基元［20］；I區(qū)幫助二聚體的轉錄因子與DNA結合形成復合體；C末端是富含疏水殘基的非保守區(qū)域。本實驗克隆得到的CcMADS-like的M區(qū)與MEF2-like蛋白高度一致（圖1），故確定為植物TypeⅡ型MADS家族成員，因為植物TypeⅠMADS蛋白的M區(qū)與ARG80/SRF-like高度相似，且植物TypeⅠMADS蛋白的K區(qū)保守性較差，序列變化多樣［21-22］。實驗所得CcMADS-like基因具有典型的TypeⅡ型MIKC結構分區(qū)［2］，多序列比對表明其具有高度保守的MADS盒和保守性較高的K區(qū)，這與其轉錄因子結合DNA和行使轉錄作用的功能相互佐證。同時也證明了M區(qū)和K區(qū)在MADS-box基因家族進化過程中保持著極高的穩(wěn)定性，是MADS轉錄因子功能的重要執(zhí)行結構。進化樹分析表明，CcMADS-like與金魚草Antirrhinum majus DEFH7和葡萄Vitis vinifera MADS6距離較近，而距離最近的美洲黑楊也疑似屬于DEFH7家族［23］，因此初步斷定實驗得到的CcMADS-like屬于DEFH7基因亞家族成員。研究表明：DEFH7基因家族根據(jù)進化分析屬于TM8家族［2，24］。然而，目前對TM8家族的功能所知甚少，擬南芥中尚未發(fā)現(xiàn)TM8家族成員，也沒有功能缺陷植株表型的描述?，F(xiàn)在可以確定的是TM8家族屬于植物MIKC型MADS-box基因；葡萄中表達水平檢測表明，TM8成員在成花過程中發(fā)揮重要功能［25］。MADS-box基因廣泛參與植物的整個生命活動過程，尤其是植物成花過程。實時定量PCR在根、莖中未檢測到明顯CcMADS-box表達，但在葉、葉芽、花芽中檢測到表達，尤其在花芽中表達含量比其他組織高約7~10倍，表現(xiàn)出明顯的組織特異性，暗示著CcMADS-like與花器官發(fā)育有著密切聯(lián)系，但具體功能機理則可能需要對該基因在花芽發(fā)育的不同階段和不同花器官表達量來確定。轉錄激活活性是轉錄因子的重要功能特征。以酵母單雜交實驗對山核桃CcMADS-like轉錄激活活性進行驗證，結果表明：CcMADS-like可以有效地激活酵母菌株中的下游報告基因，說明CcMADS-like與其他MADS蛋白一樣，確實具有轉錄激活功能。當然，要揭示CcMADS-like在山核桃成花過程中的功能機制，還有待于轉基因等方面的進一步功能驗證。

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第5屆中國森林保護學術大會暨林業(yè)有害生物綠色防控國際研討會召開

2014年10月28日至30日，由中國林學會主辦的第5屆中國森林保護學術大會暨林業(yè)有害生物綠色防控國際研討會在浙江農林大學召開。來自全國各地從事森林保護科研、教學、管理和生產的專家學者300余人參加會議。

本屆大會圍繞會議主題：森林健康——林業(yè)有害生物綠色防控，對中國森林健康所面臨的挑戰(zhàn)和綠色防控等進行了廣泛的討論與學術交流。會議設國際研討會、4個分段大會和青年學術沙龍等進行交流研討。學術報告聚焦林業(yè)有害生物流行與生態(tài)控制，林業(yè)有害生物監(jiān)測、預警及檢疫，生物農藥與綠色防控，林業(yè)有害生物基礎理論等研究，全面反映了近年來中國森林保護學科研究的最新成果。

會議期間，舉行了中國林學會森林病理學會分會理事會議。南京林業(yè)大學副校長葉建仁當選為分會理事會主任委員，浙江農林大學副校長張立欽當選為副主任委員。此次大會還為青年學者搭建了學術交流平臺。大會評選出優(yōu)秀學術報告14篇，其中一等獎2篇，二等獎4篇，三等獎8篇。

下屆中國森林保護學術大會將由中南林業(yè)科技大學承辦。

周湘

Cloning and analysis of a MADS-like gene in Carya cathayensis

HOU Chuanming,ZHENG Yawen,WANG Zhengjia,XU Yingwu
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

MADS-box family genes play key roles in all phases of floral development.Based on a partial fragment acquired from 454 sequencing of Carya cathayensis （hickory）floral buds,a full-length of a MADS-like gene was obtained by rapid amplification of cDNA ends （RACE）.Afterwards,a quantitative real-time （qRT）polymerase chain reaction （PCR）analysis,an amino acid sequence alignment,and a yeast one-hybrid assay were performed.Results of the sequence analysis revealed the open reading frame （ORF）of the Cc-MADS-like gene was 609 bp in length and encoded a protein of 202 aa.The protein presented typical characteristic of MADS-box family genes and contained MADS domain,I,K,and C,with the MADS domain was considerably conserved.The amino acid sequence alignment showed that the putative protein CcMADS-like gene had an identity to homologies of Arabidopsis thaliana （48%）,Antirrhinum majus （65%）,Populus deltoides（69%）,and Populus trichocarpa（71%）.The qRT-PCR analysis revealed that the expression level of CcMADS-like gene in flower buds was much higher than in other tissues.The yeast one-hybrid showed that the CcMADS-like gene had an activation activity as a transcription factor.Overall,the qRT-PCR analysis suggested that CcMADS-like gene possibly participated in floral development of hickory.［Ch,5 fig.1 tab.25 ref.］

cash forestry;floral development;Carya cathayensis;MADS-box;gene clone;qRT-PCR;yeast onehybrid

S664.1；S722.3

A

2095-0756（2015）01-0033-07

浙 江 農 林 大 學 學 報，2015，32（1）：33-39

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.01.005

2014-03-10；

2014-04-20

國家高技術研究發(fā)展計劃（“863”計劃）項目（2013AA102605）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目（2011CB111500）；國家自然科學基金資助項目（31170637）；浙江農林大學科研發(fā)展基金資助項目（2010FR072）

侯傳明，從事植物分子生物學研究。E-mail：houchm0927@163.com。通信作者：徐英武，教授，博士，博士生導師，從事蛋白和藥物結構生物學等研究。E-mail：yxu@zafu.edu.cn