趙 婷,韓小嬌， 劉明英，喬桂榮， 蔣 晶， 姜彥成， 卓仁英

東南景天耐鎘相關(guān)基因SaFer的克隆與功能初步分析

趙 婷1,2,3,韓小嬌2,3， 劉明英2,3，喬桂榮2,3， 蔣 晶2,3， 姜彥成1， 卓仁英2,3

（1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830046;2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江富陽311400;3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100091）

鐵蛋白（ferritin）是一種專門存儲(chǔ)鐵的重要脅迫相關(guān)蛋白，參與鎘離子吸收的調(diào)控。從構(gòu)建的東南景天Sedum alfredii cDNA文庫(kù)中篩選出東南景天Ferritin基因cDNA全長(zhǎng)，命名為SaFer，編碼序列為1 117 bp，開放閱讀框?yàn)?59 bp，編碼252個(gè)氨基酸。以東南景天基因組DNA為模板分離到SaFer基因組序列，長(zhǎng)度為1 702 bp，含有7個(gè)內(nèi)含子。氨基酸序列同源性分析表明：SaFer與蘋果Malus domestica Ferritin親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)76%。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析發(fā)現(xiàn)：根系中SaFer基因在鎘脅迫12 h后表達(dá)顯著上調(diào)。鎘脅迫實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥Arabidopsis thaliana比野生型有更高的耐鎘脅迫能力。SaFer基因的分離及其初步功能驗(yàn)證為研究東南景天耐鎘機(jī)制和林木耐鎘轉(zhuǎn)基因育種提供了理論依據(jù)。圖9表1參23

植物學(xué)；東南景天；鐵蛋白（ferritin）；鎘脅迫；表達(dá)分析

隨著中國(guó)工業(yè)化的迅速發(fā)展，土壤重金屬污染已嚴(yán)重影響了食品安全。如何治理土壤重金屬污染已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。利用超積累植物清除重金屬污染即植物修復(fù)技術(shù)以其潛在的高效、廉價(jià)和環(huán)境友好性而獲得了廣泛關(guān)注［1］。重金屬超積累植物是指其地上部積累的重金屬離子大于100 mg·kg-1，同時(shí)植物的地上部重金屬含量與根系重金屬含量的比值大于1的植物［2-3］。到目前為止，世界各地已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的超積累植物共400多種，主要是鎳（Ni）超積累植物，而鎘超積累植物比較少見。目前公認(rèn)的鎘超積累植物有遏藍(lán)菜Thlaspi caerulescens,鼠耳芥Arabidopsis halleri和東南景天Sedum alfredii［4-9］。礦山型東南景天是在浙江省衢州市廢棄的鉛、鋅礦區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種鋅（Zn2+）/鎘（Cd2+）超積累植物［10］。礦山型東南景天是經(jīng)過自然進(jìn)化的鎘超積累植物，查清東南景天重金屬超積累的分子機(jī)制對(duì)林木耐鎘新品種培育具有重要意義。鐵蛋白在植物體內(nèi)作為一種重要的脅迫反應(yīng)蛋白參與外界環(huán)境脅迫反應(yīng)。當(dāng)植物受到寒冷、干旱、重金屬離子等環(huán)境脅迫時(shí)體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有鐵蛋白的存在［11］。鐵蛋白可以儲(chǔ)存鐵原子，減少鐵介導(dǎo)的自由基反應(yīng)，從而提高植物的抗脅迫能力［12］。鐵蛋白通過芬頓反應(yīng)螯合細(xì)胞內(nèi)的鐵，從而保護(hù)植物細(xì)胞免受因各種環(huán)境脅迫而導(dǎo)致的細(xì)胞氧化性損傷［13］。此外，鐵蛋白還可以儲(chǔ)存部分重金屬離子，如Cu2+和Zn2+等，通過調(diào)節(jié)鐵離子濃度來調(diào)控代謝所需的金屬離子含量，從而抵御環(huán)境脅迫，因此，植物鐵蛋白在緩解重金屬的毒害方面也可能具有一定的作用［14］。目前，尚無東南景天Ferritin基因方面的研究。本研究是從中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（本實(shí)驗(yàn)室）前期構(gòu)建的東南景天cDNA文庫(kù)中分離克隆出1個(gè)Ferritin基因cDNA，并分析了鎘脅迫條件下東南景天根部中該基因的表達(dá)變化，及轉(zhuǎn)基因擬南芥Arabidopsis thaliana在鎘脅迫下的生理變化，為深入研究東南景天Ferritin基因如何參與鎘脅迫反應(yīng)機(jī)制及其在林木耐鎘轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株和載體

哥倫比亞生態(tài)型擬南芥Col-0，東南景天，大腸埃希菌Escherichia coli DH5α，Bl21 DE Star，根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens EHA105，植物表達(dá)載體pBI121均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pGEM-T Easy載體購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 酶和主要試劑

LA Taq高保真聚合酶、rTaq DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶Sfi I購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司，核糖核酸（RNA）提取使用總RNA純化試劑盒（NORGEN,加拿大），反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit和熒光定量試劑盒SYBR Prime ScriptTMRT-PCR Kit均購(gòu)自Takara公司（Takara,中國(guó)大連），DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司（AXYGEN,中國(guó)上海），NANODROP2000分光光度計(jì)、ABI 7300實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、TaKaRa梯度PCR儀、高速冷凍離心機(jī)5804R分別購(gòu)自美國(guó)Thermo公司、美國(guó)Applied Biosystems公司、日本TaKaRa公司和德國(guó)Eppendorf公司，DNA測(cè)序和引物合成由生工生物工程 （上海）股份有限公司完成（表1）。

1.3 東南景天SaFer基因組序列克隆及同源性分析

從本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的東南景天cDNA文庫(kù)中篩選出Ferritin基因cDNA全長(zhǎng),利用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取東南景天基因組DNA［15］。根據(jù)Ferritin基因序列設(shè)計(jì)特異性引物：ORF-F和ORF-R，以東南景天基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min；95℃變性30 s， 56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，連接T-easy載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，篩選陽性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

表1 引物名稱及對(duì)應(yīng)序列Table 1 Name and sequence of primers

將獲得的氨基酸序列與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行局部序列比對(duì)基本檢索工具（BLAST）比對(duì)，分析該基因與其他物種基因的同源性，用MEGA 4.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 東南景天根部SaFer基因鎘脅迫后表達(dá)分析

用400 μmol·L-1的氯化鎘（CdCl2）脅迫東南景天無性系植株，脅迫時(shí)間分別為0，0.5，6，12，24，48，72和96 h。按照NORGEN的RNA提取試劑盒說明，分別提取東南景天根部總RNA，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定濃度，并用體積分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖電泳分析完整性。使用Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈。反轉(zhuǎn)錄體系為2.0 μL 5×primeScript Buffer,500 ng總RNA,0.5 μL Oligo dT Primer,0.5 μL Random 6 mers,0.5 μL primeScript RTase,用RNase無核糖核酸酶水補(bǔ)足至10.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃/30 min，85℃/5 s，將合成后的cDNA稀釋10倍，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

根據(jù)cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物：Fer-RTF和Fer-RTR。參照試劑盒SYBR Prime-ScriptTMRT-PCR Kit說明書，以東南景天微管蛋白基因beta-Tubulin（TUB）為內(nèi)參：TUB-RTF和TUBRTR。反應(yīng)在ABI 7300實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為：cDNA模板2.0 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTM10.0 μL，特異引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，用水補(bǔ)足20.0 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃30 s預(yù)變性后，95℃變性5 s，60℃復(fù)性31 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)試樣平行做4次反應(yīng)，重復(fù)試驗(yàn)2次。數(shù)據(jù)分析采用ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)定量，目標(biāo)基因相對(duì)定量=2-ΔΔCT［16］。

1.5 擬南芥的轉(zhuǎn)化和篩選

參考楊靚等［17］的方法對(duì)載體pBI 121進(jìn)行改造引入Sfi I酶切位點(diǎn)獲得目的載體pBI121G，利用 sfi 1限制性內(nèi)切酶對(duì)SaFer基因片段和改造后的表達(dá)載體pBI121G進(jìn)行酶切，將相應(yīng)的目的片段連接后的植物表達(dá)載體命名為pBI121G-SaFer，并電激轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，利用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。通過PCR和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)分析轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達(dá)模式。

1.6 SaFer轉(zhuǎn)基因擬南芥的檢測(cè)

分別利用SaFer特異引物PCR和RT-PCR相結(jié)合篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株。擬南芥幼苗移栽于營(yíng)養(yǎng)土22 d后，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書分別提取野生型和PCR陽性株系擬南芥葉片總RNA，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對(duì)提取得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄，并將合成的cDNA稀釋10倍，用于熒光定量PCR分析。

設(shè)計(jì)東南景天Ferritin基因熒光定量PCR引物：Fer-RTF和Fer-RTR，以擬南芥Actin為內(nèi)參基因：AtActin-RTF和AtActin-RTR（表1），反應(yīng)在ABI 7300實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鎘性試驗(yàn)

1.7.1 種子萌發(fā)試驗(yàn) 為了分析不同濃度鎘離子脅迫對(duì)擬南芥種子發(fā)芽率的影響，將收獲的轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代種子和野生型擬南芥種子經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒后，挑選均勻飽滿的種子各20粒，播種在含不同氯化鎘濃度（0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0 mmol·L-1）的1/2MS的固體培養(yǎng)基上，4℃處理2 d，之后置于23℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。以胚根突破種皮0.5 mm為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每天觀察種子萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)數(shù)。隨后選擇氯化鎘濃度為1.5 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1，處理方法同上，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)數(shù)，分析處理后第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率［18］，發(fā)芽率=（供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子）×100%。

1.7.2 鎘脅迫條件生理試驗(yàn) 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的處理方法同上，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d后，移栽至營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)40 d，用含2 mmol·L-1氯化鎘的Hoagland浸泡轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥，以未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥為對(duì)照，測(cè)定處理1,3,6 d后擬南芥葉片的生理指標(biāo)：超氧化物歧化酶（SOD）活性采用四氮唑藍(lán)（NBT）光還原法測(cè)定［19］；質(zhì)膜相對(duì)透性用DDS-11A型電導(dǎo)率儀測(cè)定［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 東南景天SaFer基因cDNA及DNA序列分析

對(duì)從東南景天cDNA文庫(kù)中篩選出的鐵蛋白基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確認(rèn)其為全長(zhǎng)cDNA序列，將其命名為SaFer（登錄號(hào)為KF850427），cDNA長(zhǎng)為1 117 bp，含有1個(gè)759 bp的開放讀碼框，5′UTR長(zhǎng)73 bp，3′UTR長(zhǎng)285 bp，編碼252個(gè)氨基酸。根據(jù)SaFer基因cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，以東南景天基因組DNA為模板分離到了SaFer基因組序列，長(zhǎng)為1 702 bp（登錄號(hào)為KF850428）。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，東南景天SaFer基因含有7個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度與位置分別為104 bp（376~479 bp），67 bp（564~ 630 bp），80 bp（692~771 bp），446 bp（860~1 305 bp），99 bp（1 368~1 466 bp），81 bp（1 533~ 1 613 bp）和66 bp（1 686~1 751 bp）（圖1）。將東南景天SaFer與部分植物蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)與親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)（圖2），SaFer與蘋果Malus domestica的同源性最高（76%），而與擬南芥的同源性最低（65%）。

圖1 SaFer基因組結(jié)構(gòu)Figure 1 Gene structure of SaFer

圖2 SaFer與其他植物Ferritin的進(jìn)化關(guān)系Figure 2 Phylogenetic tree besed on Ferritin of Sedum alfredii and other species

2.2 SaFer基因在東南景天根部的表達(dá)分析

將提取的根部總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后利用qRT-PCR分析SaFer基因的表達(dá)情況。從圖3可以看出SaFer基因在東南景天脅迫12 h時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照的8.5倍，24 h急劇下降至對(duì)照的2.0倍，之后隨著脅迫時(shí)間的增加，表達(dá)量緩慢上升。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

提取轉(zhuǎn)基因陽性植株和野生型擬南芥葉片的DNA，以SaFer基因的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)基因陽性植株可以擴(kuò)增出約750 bp的目的條帶，而野生型擬南芥沒有PCR產(chǎn)物（WT），選擇其中2個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性株系命名為A1-1和A1-2。

提取擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性植株以及野生型植株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后利用qRT-PCR分析目的基因SaFer的表達(dá)情況，從圖5可以看出東南景天SaFer基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型擬南芥，而在野生型擬南芥中未檢測(cè)到其表達(dá)。

圖3 不同脅迫時(shí)間SaFer基因的表達(dá)分析Figure 3 Expression levels of SaFer at different stress times

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測(cè)Figure 4 PCR analysis of transgenic Arabdopsis thaliana

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達(dá)分析Figure 5 Expression levels of transgenic Arabidopsis thaliana

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鎘抗性試驗(yàn)

2.4.1 擬南芥種子的萌發(fā)試驗(yàn) 為了解鎘離子（Cd2+）脅迫對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的影響，需要確定合適的鎘處理濃度。實(shí)驗(yàn)用不同濃度氯化鎘處理轉(zhuǎn)基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子，觀察其萌發(fā)的情況。如圖6所示，Cd2+處理抑制擬南芥種子萌發(fā)，且不同濃度的Cd2+對(duì)擬南芥種子萌發(fā)率的抑制作用差異顯著。在Cd2+濃度為0.5 mmol·L-1時(shí)擬南芥種子的萌發(fā)率與對(duì)照差別不大，隨著Cd2+濃度的增加萌發(fā)率下降，到2.0 mmol·L-1明顯下降，說明擬南芥種子對(duì)1.5和2.0 mmol·L-1的Cd2+濃度比較敏感，并且轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率均高于野生型。脅迫條件下種子發(fā)芽率可以反應(yīng)轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性。從圖7可見：處理前，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥A1-1和A1-2的種子發(fā)芽率差異不顯著，而當(dāng)Cd2+濃度為1.5和2.0 mmol·L-1時(shí)，野生型種子的萌發(fā)率分別是18%和11%，而轉(zhuǎn)基因株系平均發(fā)芽率分別為79%和67%，顯著高于野生型（P＜0.005）。

2.4.2 生理指標(biāo)的測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）是一種清除超氧陰離子自由基的酶。鎘脅迫會(huì)引起活性氧在植物中過量積累。從圖8可以看出：野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥在無脅迫處理時(shí)SOD酶活性基本一致，野生型擬南芥的SOD活性為405.2×16.67 nkat·g-1，轉(zhuǎn)基因擬南芥SOD活性平均為421.3× 16.67 nkat·g-1，脅迫處理1,3,6 d后，所有植株的SOD活性均上升，野生型擬南芥中的SOD活性分別上升至483.7，522.8和561.5×16.67 nkat·g-1，分別比處理前上升了19.4%，29%和38.6%，而轉(zhuǎn)基因擬南芥中SOD酶的活性則上升至565，608.7和666.2×16.67 nkat·g-1，同比上升了34.2%，44.6% 和58.2%。雖然兩者的SOD活性鎘脅迫后都呈增加的趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因擬南芥的SOD活性增加幅度明顯高于野生型擬南芥，說明SaFer基因表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥鐵離子螯合能力，增加SOD活性來清除過氧化物的傷害，進(jìn)而提高植物對(duì)鎘脅迫的耐受能力。當(dāng)植物受到逆境影響時(shí)，細(xì)胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致電導(dǎo)率增大，膜透性變化的程度可以反應(yīng)植物抗逆性的強(qiáng)弱。如圖9所示：在未處理情況下野生型擬南芥電導(dǎo)率為0.086 S·m-1，轉(zhuǎn)基因擬南芥電導(dǎo)率為0.088 S·m-1，兩者基本相似。脅迫1，3，6 d后，野生型擬南芥葉片電導(dǎo)率分別上升至0.116，0.183和0.245 S·m-1，比處理前分別上升了35.2%，112.9%和185.2%，轉(zhuǎn)基因擬南芥電導(dǎo)率分別上升至0.01，0.12和0.171 S· m-1，同比分別上升了13.9%，37.9%和94.5%。野生型擬南芥的葉片電導(dǎo)率增加幅度大于轉(zhuǎn)基因擬南芥。這表明鎘脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的傷害低于野生型擬南芥，從而說明SaFer基因表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鎘脅迫的抗性。

圖6 不同濃度鎘離子（Cd2+）脅迫下轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥種子發(fā)芽率Figure 6 Germination rate of transgenic and wild type Arabidopsis thliana seeds under the stress of different concentrations Cd2+

圖7 不同濃度鎘離子（Cd2+）脅迫下轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥種子發(fā)芽率Figure 7 Germination of transgenic and wild type Arabidopsis thliana seeds under the stress of Cd2+

圖8 脅迫前后不同擬南芥株系葉片SOD變化Figure 8 SOD activity in Arabidopsis thliana leaf under Cd2+stress

圖9 脅迫前后不同擬南芥株系葉片電導(dǎo)率的變化Figure 9 Conductivity in Arabidopsis thliana leaf under Cd2+stress

3 討論

隨著社會(huì)工業(yè)化的迅猛發(fā)展，含有重金屬的污染物大量排放，嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境和農(nóng)田土壤，導(dǎo)致重金屬離子從土壤和水體中進(jìn)入植物體內(nèi)，影響了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量，并通過食物鏈進(jìn)入人體，危害健康，如何高效、綠色清除重金屬污染已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)問題。本研究以超積累植物東南景天耐鎘相關(guān)基因SaFer為研究對(duì)象，通過生物信息學(xué)、熒光定量PCR以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)等方面初步分析了SaFer基因功能，為解析SaFer基因在東南景天鎘超積累過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

目前在水稻Oryza sativa，蘋果和蘿卜Raphanus sativus等植物的研究中都發(fā)現(xiàn)Ferritin基因的表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)重金屬的耐受性［21］。本實(shí)驗(yàn)室利用擬南芥花序侵染法將SaFer基因轉(zhuǎn)到擬南芥中，通過PCR和qRT-PCR證實(shí)了該基因已經(jīng)整合到擬南芥基因組中并能在擬南芥中正常表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示：鎘脅迫處理后，根部中SaFer基因在鎘脅迫12 h后表達(dá)量顯著上調(diào)，為對(duì)照的8.5倍，24 h急劇下降至對(duì)照的2倍，后隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量緩慢上升，推測(cè)該基因?yàn)橹泻笃陧憫?yīng)基因。將轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥種子播種在含有不同鎘離子（Cd2+）濃度處理的培養(yǎng)基中進(jìn)行脅迫處理，分析發(fā)現(xiàn)SaFer基因可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鎘能力。Goto等［22］推測(cè)可能是因?yàn)殍F蛋白不僅能結(jié)合植物體內(nèi)游離的鐵離子，而且能很容易地結(jié)合其他重金屬離子，抵御氧化脅迫的引起的傷害。鎘脅迫對(duì)擬南芥種子的萌發(fā)影響較大，隨著鎘離子（Cd2+）濃度升高，種子發(fā)芽率降低，但轉(zhuǎn)基因擬南芥均高于野生型，并且當(dāng)鎘離子（Cd2+）濃度大于1.5 mmol·L-1時(shí)，萌發(fā)率明顯下降。選擇1.5 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1的鎘離子（Cd2+）濃度處理轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥種子發(fā)芽率，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的發(fā)芽率明顯高于野生型，達(dá)到顯著性差異，說明轉(zhuǎn)SaFer基因擬南芥種子具有較高的耐鎘脅迫能力。環(huán)境脅迫會(huì)使植物體內(nèi)積累過量的超氧負(fù)離子和過氧化物，這些物質(zhì)會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，損傷細(xì)胞，脅迫處理后轉(zhuǎn)基因植株的生理生化變化能反應(yīng)植株抗逆能力的強(qiáng)弱。用2.0 mmol·L-1氯化鎘脅迫轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥，初步測(cè)定擬南芥的生理生化指標(biāo)，分析結(jié)果表明：隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，鎘對(duì)擬南芥的傷害越嚴(yán)重。轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的超氧化物歧化酶（SOD）活性均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但轉(zhuǎn)基因株系的增長(zhǎng)幅度均高于野生型；葉片電導(dǎo)率也隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但野生型的上升幅度明顯高于轉(zhuǎn)基因。說明轉(zhuǎn)基因擬南芥能更多地清除過氧化物的傷害，抵御鎘離子對(duì)細(xì)胞膜的破壞，從而維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，比野生型擬南芥有更高的鎘耐受性，這與秦天才等［23］的分析表現(xiàn)出類似的結(jié)果。

［1］ WATANABE M E.Phytoremeditation on the brink of Commercialization［J］.Environ Sci Technol,1997,31（4）:182 -186.

［2］ BAKER A J M,REEVES R D,HAJAR A S M.Heavy metal accumulation and tolerance in British populations of the metallophyte Thlaspi caerulescens J.&C.Presl（Brassicaceae）［J］.New Phytol,1994,127（1）:61-68.

［3］ SHEN Zhenguo,ZHAO F J,McGRATH S P.Uptake and transport of zinc in the hyperaccumula tor Thlaspi caerulescens and the non-hyperaccumulator Thlaspi ochroleucum［J］.Plant Cell Environ,1997,20（7）:898-906.

［4］ LASAT M,BAKER A J M,KOCHIAN L V.Physiological characterization of root Zn2+absorption and translocation to shoots in Zn hyperaccumulator and nonaccumulator species of Thlaspi［J］.Plant Physiol,1996,112（4）:1715-1722.

［5］ LASAT M M,BAKER A J M,KOCHIAN L V.Altered Zn compartmentation in the root symplasm and stimulated Zn absorption into the leaf as mechanisms involved in Zn hyperaccumulation in Thlaspi caerulescens［J］.Plant Physiol, 1998,118（3）:875-883.

［6］ BERT V,MACNAIR M R,DELAGUERIE P,et al.Zinc tolerance and accumulation in metallicolous and nonmetallicolous populations of Arabidopsis halleri（Brassicaceae）［J］.New Phytol,2000,146（2）:225-233.

［7］ BERT V,BONNIN I,SAUMITOU-LAPRADE P,et al.Do Arabidopsis halleri from nonmetallicolous populations accumulate zinc and cadmium more effectively than those from metallicolous populations?［J］.New Phytol,2002,155 （1）:47-57.

［8］ YANG Xiao’e,LONG Xinxian,NI Wuzhong,et al.Sedum alfredii H.:a new Zn hyperaccumulating plant first found in China［J］.Chin Sci Bull,2002,47（19）:1003-1006.

［9］ YANG Xiaoe,LONG Xinxian,YE Haibo,et al.Cadmium tolerance and hyperaccumulation in a new Znhyperaccumulating plant specie（Sedum alfredii Hance）［J］.Plant Soil,2004,259（1）:181-189.

［10］ LONG Xinxian,YANG Xiaoe,YE Zhengqian,et al.Differences of uptake and accumulation in four species of Sedum ［J］.Acta Bot Sin,2002,44（2）:152-157.

［11］ 徐曉暉,郭澤建,程志強(qiáng),等.鐵蛋白基因的水稻轉(zhuǎn)化及其功能初步分析［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2003,29（1）:49-54. XU Xiaohui,GUO Zejian,CHENG Zhiqiang,et al.Analysis of rice transformation and the function of Ferritin gene ［J］.J Zhejiang Univ Agric Life Sci,2003,29（1）:49-54.

［12］ BRIAT J F.Roles of ferritin in plants［J］.J Plant Nutr,1996,19（8/9）:1331-1342.

［13］ DEáK M,HORVáTH G,DAVLETOVA S,et al.Plants ectopically expressing the iron binding protein,ferritin,are tolerant to oxidative damage and Pathogens［J］.Nat Biotechnol,1999,17（2）:192-196.

［14］ THEIL E C,Ferritin:structure,gene regulation,and cellular function in animals,plants,and microoganisms［J］. Annu Rev Biochem,1987,56:289-315.

［15］ 王關(guān)林,方紅筠.植物基因工程［M］.2版.北京:科學(xué)出版社,2002:744.

［16］ LIVAK K J.SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））method［J］.Methods,2001,25（4）:402-408.

［17］ 楊靚,紀(jì)巍,朱延明.滲透脅迫相關(guān)基因高通量篩選技術(shù)體系的建立［J］.中國(guó)生物工程雜志,2008,28（6）:60-64. YANG Liang,JI Wei,ZHU Yanming.Establishment of genes related to osmotic stress technique of high throughput screening system［J］.China Biotechnol,2008,28（6）:60-64.

［18］ 何俊瑜,任艷芳,任明見,等.鎘對(duì)不同小麥品種種子萌發(fā)的影響［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25（10）:235-240. HE Junyu,REN Yanfang,REN Mingjian,et al.Effects of cadmium on seed germination of different wheat varieties ［J］.Chin Agric Sci Bull,2009,25（10）:235-240.

［19］ GIANNOPOLITIS C N,RIES S K.Superoxide dismutases（Ⅰ）Occurrence in higher plants ［J］.Plant Physiol,1977, 59（2）:309-314.

［20］ FAN Lu,ZHENG Suqing,WANG Xumin.Antisense suppression of phospholipase D alpha retards abscisic acid-ethylene-promoted senescence of postharvest Arabidopsis leaves［J］.Plant Cell Online,1997,9（12）:2183-2196.

［21］ 賀曉燕.蘿卜鎘脅迫響應(yīng)相關(guān)基因克隆及其表達(dá)分析［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011. HE Xiaoyan.Radish Cd Stress Response Related Gene Cloning and Expression Analysis［D］.Nanjing:Nanjing Agricultural University,2011.

［22］ GOTO F,YOSHIHARA T,SHIGEMOTO N,et al.Iron fortification of rice seed by the soybean ferritin gene［J］.Nat Biotechnol,1999,17（3）:282-286.

［23］ 秦天才,阮捷,王臘嬌.鎘對(duì)植物光合作用的影響［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2000（增刊）:33-44. QIN Tiancai,RUAN Jie,WANG Lajiao.Effects of cadmium on plant photosynthesis［J］.Environ Sci Technol,2000 （supp）:33-44.

Isolation and expression of a cadmium-resistant gene（SaFer）from Sedum alfredii

ZHAO Ting1,2,3,HAN Xiaojiao2,3,LIU Mingying2,3,QIAO Guirong2,3,JIANG Jing2,3, JIANG Yancheng1,ZHUO Renying2,3
（1.Department of Biology and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,Xinjiang,China;2.The Research Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry,Fuyang 311400,Zhejiang,China;3.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091,China）

Abiotic stress was a Serious problem that affect plants growth and products.In plants,ferritin is a special iron storage protein closely related to stress.A cDNA from the Sedum alfredii cDNA library,designated as SaFer,was isolated and analyzed by homologous analysis and by Real-Time Reverse Transcription-PCR （qRT-PCR）.Then,cadmium-stress experiments were conducted to compare transgenic Arabidopsis thaliana overexpressed SaFer to a wild type.Results showed that SaFer cDNA was 1 117 bp long with an opening reading frame （ORF）of 759 bp.The ORF of SaFer encoded a polypeptide of 252 amino acids with a calculated molecular weight of about 27.8 kDa,and the homologous analysis showed that it was most closely related to ferritin of Malus domestica with 76%identities.The length of the genomic sequence of SaFer was 1 702 bp and contained 7 introns.Expression profiles in roots were analyzed by qRT-PCR and the results showed that the transcription level of SaFer was enhanced after 12 h cadmium stress.Transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing SaFer displayed much higher Cd tolerance than the wild type which was further supported by physio-logical indexes such as SOD activity and electric conductivity.The results showed that SaFer could provide a glimpse into S.alfredii cadmium-tolerance and could contribute to the breeding of cadmium-tolerant plants. ［Ch，9 fig.1 tab.23 ref.］

botany；Sedum alfredii;ferritin;cadmium stress;expression change

S718.3；Q943.2

A

2095-0756（2015）01-0025-08

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)，2015，32（1）：25-32

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.01.004

2014-03-01；

2014-04-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31200465）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102701-3）

趙婷，從事植物分子生物學(xué)研究，E-mail:1458373105@qq.com。通信作者：卓仁英，研究員，博士，從事植物抗逆分子生物學(xué)研究，E-mail:zhuory@gmail.com；姜彥成，副教授，從事分子生物學(xué)研究。E-mail:xjzkjyc@xju.edu.cn