龐 景，童再康，黃華宏，林二培，劉瓊瑤

杉木纖維素合成酶基因CesA的克隆及表達(dá)分析

龐 景，童再康，黃華宏，林二培，劉瓊瑤

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)，從杉木Cunninghamia lanceolata中克隆到2個全長為3 235 bp和3 876 bp的纖維素合成酶基因cDNA序列，被分別命名為ClCesA1和ClCesA2，GenBank登錄號分別為JQ844574和JQ844575。相應(yīng)編碼蛋白分別包含992和1 092個氨基酸殘基，推測分子量為111 845.3 D和123 105.7 D，等電點為6.04和6.65。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，它們具有植物纖維素合成酶基因相應(yīng)的結(jié)構(gòu)特征——鋅指結(jié)構(gòu)，2個易變區(qū)CSRI和CSRII，2個保守區(qū)CRI和CRII，纖維素合成酶底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域 “D, D,D,QVLRW”，以及8個跨膜區(qū)。熒光定量PCR分析表明： ClCesA1和ClCesA2基因在莖中表達(dá)豐度均為最高，且成熟木質(zhì)部中表達(dá)量均高于皮層中的相應(yīng)數(shù)值；2個基因在根和針葉中的表達(dá)量相對較低。以具特殊材質(zhì)性狀的矮生杉木和正常杉木木質(zhì)部為材料的進(jìn)一步表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：ClCesA1和ClCesA2在正常杉木木質(zhì)部中的表達(dá)量大約是矮生杉木表達(dá)量的2～12倍。2個杉木CesA基因可能在杉木木材形成過程中具有重要作用。圖5參19

林木育種學(xué)；杉木；CesA基因；基因克??；序列分析；表達(dá)分析

纖維素是木材的主要成分之一，約占木材干質(zhì)量的40%以上，是木材品質(zhì)的主要決定因子。纖維素是由β-1,4-葡萄糖殘基組成的不分支多糖，它的合成涉及一個復(fù)雜的酶系，其中由纖維素合成酶催化亞基（CESA）組成的復(fù)合酶是關(guān)鍵酶之一。因此，CesA基因的克隆及其功能解析一直是植物分子生物學(xué)領(lǐng)域中的一個研究熱點。1996年，Pear等［1］分離鑒定了高等植物中的第1個CesA基因，即來自棉花Gossypium hirsutum的GhCesA1。美國的密歇根大學(xué)2000年從歐洲顫楊Populus tremuloides中克隆到了林木中的第1個纖維素合成酶基因PtrCesA1基因，它是一個在木質(zhì)部特異表達(dá)的纖維素合成酶基因，與次生壁的形成有關(guān)［2］。此后來自擬南芥Arabdopsis thaliana的10個AtCesA，毛果楊Populus trichocarpa 的18個PtriCesA，以及歐洲顫楊、赤桉Eucalyptus camaldulensis等植物的部分CesA基因相繼被鑒定［3-5］，尤其是通過突變體分析，來自擬南芥的9個AtCesA功能已基本被解析［6］,其中AtCesA1，AtCesA3，AtCesA6與細(xì)胞初生壁的形成相關(guān)，而AtCesA4，AtCesA7，AtCesA8［7］都只在有次生壁的細(xì)胞中表達(dá)，可能與細(xì)胞次生壁的形成有關(guān)。歐洲顫楊中的PtrCesA2［8］和PtrCesA5［9］基因主要在正在發(fā)育的木質(zhì)部表達(dá)，參與次生壁的形成。來自赤桉的EcCesA4，EcCesA5與初生壁合成有關(guān)，EcCesA1，EcCesA2和EcCesA3［10］則參與次生壁合成。這些基因的研究為其他植物纖維素合成機(jī)制的解析奠定了堅實的基礎(chǔ)。杉木Cunninghamia lanceolata是中國南方重要的針葉速生用材樹種，用途廣泛。近年來有關(guān)杉木材性性狀形成分子機(jī)制的研究取得了明顯進(jìn)展［11-13］，然而涉及其纖維素生物合成分子機(jī)制的研究報道甚少，僅彭沙沙等［14］克隆了杉木纖維素合成酶類似蛋白ClCslD1，并對它進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。本研究利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)，分離克隆了2個杉木CesA基因，對它們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以及在不同器官（或組織）表達(dá)差異分析，以期為進(jìn)一步的功能解析提供實驗依據(jù)，同時也為杉木分子輔助育種提供重要基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗材料為杉木速生無性系B057和矮生無性系，均栽植于浙江省臨安市橫畈林場。在2012年6月下旬，采集正常速生無性系的當(dāng)年生成熟針葉、莖、根，以及正常速生杉木和矮生杉木1年生莖段的皮層、正常發(fā)育的木質(zhì)部。所有材料液氮速凍之后存放在-80℃冰箱中備用。

1.2 實驗試劑

克隆用的大腸埃希菌Escherichia coli DH5α為本實驗室保存；SMARTTMRACE cDNA-amplification-kit （Clontech）；PureLinkTMplant RNA reagent提取試劑盒（上海英駿生物技術(shù)有限公司）；Peasy-T1 simple cloning kit（TransGen Biotech）；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AxyGEN）；PCR反應(yīng)試劑10×buffer（緩沖液），脫氧核苷三磷酸（dNTPs），Taq DNA聚合酶均購自上海生物工程技術(shù)有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.3 總RNA的提取和cDNA合成

總RNA的提取采用PureLinkTMplant RNA reagent試劑盒進(jìn)行；cDNA第1鏈的合成則采用購自大連TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。

1.4 ClCesA基因的擴(kuò)增

根據(jù)已報道的其他植物CesA基因序列，在纖維素合成酶保守區(qū)域設(shè)計RT-PCR上游引物RR：5′＞TGYTAYGTNCARTTYCCWC＜3′，下游引物RF：5′＞GANCCRTADATCCANCC＜3′（Y：C or T；N：A or T or C or G；R：A or G；W：A or T；D：A or G or T）。ClCesA基因中間片段的獲得參照RrimscriptTMRTPCR kit試劑盒（TaKaRa）步驟來進(jìn)行。PCR產(chǎn)物回收后連接到Peasy-T1 simple cloning vector（TransGen Biotech）上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，篩選陽性克隆后送華大基因公司測序。根據(jù)RT-PCR片段的序列測定結(jié)果以及局部序列的比對結(jié)果，分別合成ClCesA5′RACE和3′RACE特異引物。

5′RACE和3′RACE具體步驟均參照SMATRTMRACE cDNA amplification kit（ClonTech）的說明書進(jìn)行，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收測序后，與已克隆的ClCesA基因片段拼接，從而獲得全長cDNA序列。根據(jù)拼接得到的ClCesA全長cDNA序列設(shè)計特異引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增、測序，驗證其準(zhǔn)確性。相應(yīng)引物序列如下。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用Nucleic Tools（http://srs.ebi.ac.uk/tooLs）分析目的基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成；用ProtParam （http://www.expasy.org/tooLs/protparam.html）工具推測其分子量和等電點（PI）；用ProtScale（http://ca.expasy. org/tools/protscale.html）工具推測其疏水性；用TMHMM（http://www.cds.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對其跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測；并用SignalP（http://www.cds.dtu.dk/services/SignaLP/）軟件對其N端進(jìn)行分析；在（http:// www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/Subloc/）進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；同時用ExPASy的HNN（http://www.expasy. org/tooLs/HNN.html）預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行；利用蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域推測工具InterProScan（http://ebi.ac.uk/ Tools./InterProScan/）分析結(jié)構(gòu)域；利用MEGA 4.0的鄰接（NJ）算法構(gòu)建CesA蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 基因表達(dá)的定量PCR分析

以正常杉木根、莖、葉、木質(zhì)部和皮層，矮生杉木木質(zhì)部的cDNA為模板，利用實時熒光定量PCR檢測ClCesA1和ClCesA2在不同器官和組織中的表達(dá)變化，采用TaKaRa公司的定量PCR專用的PrimeScriptRreagent kit和SYBRRPremix ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒，以ClActin作為內(nèi)參。

ClCesA1基因引物序列5′端引物序列：5′＞GAGCAAATCTCAGACTCCTACTC＜3′；3′端引物序列：5′＞TATATCCCTACGACTCTGTCCAC＜3′。ClCesA2基因引物序列 5′端引物序列：5′＞GCATCCATTTTCTCCTTGCTTTG＜3′；3′端引物序列：5′＞ATTGCTGTTTGCCCAACATCAGT＜3′。ClActin基因引物序列 5′端引物序列：5′＞CAGCAACTGGGATGATATGG＜3′；3′端引物序列：5′＞ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT＜3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木ClCesA1，ClCesA2基因的克隆與生物信息學(xué)分析

本研究通過RACE技術(shù)，成功克隆到杉木的2個ClCesA基因，cDNA長度分別為3 235 bp和3 876 bp，分別編碼992，1 092個氨基酸殘基，其在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）上的登錄號分別為JQ844574，JQ844575。經(jīng)與 NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析，ClCesA1氨基酸序列與火炬松 Pinus taeda （AAX18647.1），光皮樺Betula luminifera（ACJ38664.1），巨桉Eucalyptus grandis（AAY60843.1）等CesA家族中部分成員序列同源性高達(dá) 82%，73%，73%。ClCesA2氨基酸序列與苧麻 Boehmeria nivea （AAY78952.3），馬占相思Acacia mangium（AAT66940.1），巨桉（AAY60847.1）等CesA家族中部分成員序列同源性高達(dá)84%，81%，81%。

2個推測ClCESA蛋白相對分子質(zhì)量分別為111 845.3 D，123 105.7 D，等電點分別為6.04和6.65；半衰期都大于30 h，不穩(wěn)定系數(shù)分別為35.15和39.02，屬于穩(wěn)定蛋白。蛋白保守功能結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果顯示：這2個蛋白都具有1個纖維素的合成功能域，該結(jié)構(gòu)域為纖維素合成酶蛋白家族的1個特征性結(jié)構(gòu)域，具有催化尿苷二磷酸形成的功能。通過與來自白樺Betula platyphylla，歐洲顫楊，馬占相思和巨桉等植物中已鑒定的CESA進(jìn)行氨基酸序列比對和結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)2個CESA蛋白與來自其他植物的CESA蛋白一樣都含有鋅指結(jié)合域；2個易變區(qū)域CSRI和CSRII，CSRI緊跟鋅指結(jié)構(gòu)域后面，由88～166個氨基酸殘基組成，CSRII位于CRI和CRII之間，相比CSRI略短；2個高度保守區(qū)域CRI和CRII，CRI位于CSRI之后，由394個氨基酸殘基組成，而CRII則鄰近碳端，由316或317個氨基酸殘基組成。這2個保守區(qū)內(nèi)含有纖維素合成酶底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域 “D,D,D,QVLRW”（圖1，D：天冬氨酸，Q：谷氨酸，V：纈氨酸，R：精氨酸，W：色氨酸），其第1個和第2個D殘基位于CRI內(nèi)，第3個D殘基和QVLRW序列位于CRII內(nèi)。跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測表明：ClCESA1蛋白擁有8個跨膜區(qū)，分別是182～204，211～230，767～789，801～823，838～860，885～907，917～939和952～971，跨膜螺旋長度最小19個氨基酸殘基，最大22個氨基酸殘基，平均長度為21.25個氨基酸殘基。所有這些結(jié)果基本符合目前已知高等植物CESA蛋白的特征，進(jìn)一步說明了分離的2個ClCesA基因序列確實為杉木CesA基因。ClCESA1蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，а-螺旋（helix）占34.51%，β-折疊（sheet）占14.03%，無規(guī)則卷曲（coil）占51.46%；疏水性/親水性分析結(jié)果表明：疏水性最大值為3.311，最小值為-3.222，總體看屬于親水性蛋白。ClCESA2中а-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲分別占33.09%，15.95%，50.96%；疏水性最大值和最小值分別為3.278和-3.544，也屬親水性蛋白。此外，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測認(rèn)定這2個蛋白都屬于細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)（可靠性指標(biāo)為2；預(yù)期準(zhǔn)確性為74%），而且SignaLP軟件分析2個蛋白都為非分泌蛋白，不具有信號肽結(jié)構(gòu)。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析

將2個預(yù)測的CLCESA蛋白與來自4種雙子葉植物、2種單子葉植物和3種裸子植物全長CESA氨基酸序列進(jìn)行比對和構(gòu)建進(jìn)化樹［15］（圖2）?？梢钥闯觯篊lCesA1和ClCesA2與對應(yīng)的火炬松、擬南芥、歐洲顫楊、巨桉、水稻Oryza sativa等直系同源蛋白聚在一起，分屬于2個與細(xì)胞壁物質(zhì)形成相關(guān)的類群。在每個類群中，來自單、雙子葉植物和裸子植物的CesA基因都分別聚類在一起，暗示在裸子植物與被子植物，或單子葉植物與雙子葉植物分化之前，多數(shù)CesA進(jìn)化產(chǎn)生了不同的類型。ClCesA1與PtCesA1同源性最高，并與歐洲顫楊PtrCesA1，水稻OsCesA4，巨桉EgCesA1，擬南芥AtCesA8等聚類在一個大的分支內(nèi)；ClCesA2與玉米Zea mays ZmCesA2，歐洲顫楊PtrCesA4，水稻OsCesA1，巨桉EgCesA5，擬南芥AtCesA1等聚類在一個大的分支內(nèi)。

2.3 不同器官中ClCesA的表達(dá)差異

首先，利用RT-PCR和定量PCR產(chǎn)物的融解曲線分析和克隆測序等方法，對設(shè)計的2對ClCesA定量PCR引物的特異性和正確性進(jìn)行了驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：擴(kuò)增特異且產(chǎn)物大小、序列正確，可用于后續(xù)定量PCR分析。通過對不同器官中ClCesA基因表達(dá)情況分析得出（圖3），目的基因在杉木的根、莖、葉中都有表達(dá)，但表達(dá)模式卻不同：ClCesA1，ClCesA2基因在莖中表達(dá)豐度最高，ClCesA1在根中的表達(dá)量最低，而ClCesA2基因在根和葉中的表達(dá)豐度無顯著差異。為了初步探討目的基因在木材形成中的作用，進(jìn)一步以莖的木質(zhì)部和皮層為材料進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：2個ClCesA基因在木質(zhì)部中表達(dá)豐度均顯著高于在皮層中的相應(yīng)數(shù)值（圖4）。同時，本研究以具特殊材質(zhì)表型的矮生杉木木質(zhì)部為材料進(jìn)行目的基因表達(dá)量測定，發(fā)現(xiàn)ClCesA1和ClCesA2在正常杉木木質(zhì)部中的表達(dá)量明顯高于矮生杉木，相應(yīng)數(shù)值是矮生杉木表達(dá)量的2～12倍（圖5）。

3 討論

本實驗通過應(yīng)用RACE技術(shù)，2個杉木ClCesA基因的cDNA序列被成功分離，它們均具有完整的開放閱讀框（ORF），且編碼的CESA均包含高等植物CESA蛋白應(yīng)有序列特征。從基于氨基酸序列相似性的分析結(jié)果看，分別來自擬南芥、楊樹和巨桉的AtCesA8，PtrCesA1，EgCesA1等是ClCesA1的直系同源基因。擬南芥AtCesA8［17］是次生壁形成所必需的基因，主要在花序莖中表達(dá)，在缺少次生木質(zhì)部的幼葉和花等器官中微弱表達(dá)。從歐洲顫楊中克隆的PtrCesA1［8］基因在已發(fā)育木質(zhì)部的次生壁合成中特異表達(dá)，但在韌皮部纖維中卻不表達(dá)。EgCesA1也主要在木質(zhì)部中表達(dá)，而在無次生壁發(fā)生的組織中微弱表達(dá)［17］。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)：ClCesA1在莖中的表達(dá)量最高，且在莖的木質(zhì)部部位優(yōu)勢表達(dá)。矮生杉木在解剖與生理方面不同于正常杉木，矮生杉木木質(zhì)部細(xì)胞分化緩慢，木材中纖維素含量相對低［18］。進(jìn)一步的表達(dá)分析也發(fā)現(xiàn)：ClCesA1在矮生杉木木質(zhì)部的轉(zhuǎn)錄豐度顯著低于正常杉木的相應(yīng)數(shù)值。因此，可以推測ClCesA1是參與杉木木材次生壁形成的重要基因。進(jìn)化樹分析顯示ClCesA2與AtCesA1，PtrCesA4，EgCesA5等聚在一起。AtCesA1［16］幾乎在擬南芥的各個部位都表達(dá)，其表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AtCesA9［19］，被認(rèn)為主要參與細(xì)胞初生壁的形成。PtrCesA4［8］和EgCesA5［17］也被認(rèn)為控制初生細(xì)胞壁中纖維素的合成。然而，定量PCR分析結(jié)果顯示，ClCesA2呈現(xiàn)與ClCesA1相似的表達(dá)模式，也主要在莖的木質(zhì)部表達(dá)?？梢?，ClCesA2是否直接參與細(xì)胞次生壁的形成有待驗證。

圖1 不同植物CESA氨基酸序列比對及其基序分析Figure 1 Amino acid residue alignment and motif analysis of different plant CESA sequences

圖2 植物CESA蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Figure 2 Phylogenetic tree analysis of CESA from different plant species

圖3 不同器官中ClCesA1和ClCesA2基因的相對表達(dá)量Figure 3 Relative expression levels of ClCesA1,ClCesA2 in different organs

植物CesA基因是以超基因家族存在的，含有許多的基因成員，不同的成員參與不同組織，不同器官或不同細(xì)胞壁層次的纖維素合成。本研究雖從杉木中克隆到了2個CesA基因，但其他CesA基因成員還未克隆到，同時這2個基因的功能還需進(jìn)行更深入的研究。

［1］ PEAR J R,KAWAGOE Y,SCHRECKENGOST W E,et al.Higher plants contain homologs of the bacterial celA genes encoding the catalytic subunit of cellulose synthase［J］.Proc Nat Acad Sci USA,1996,93（22）:12637-12642.

［2］ WU Luguang,JOSHI C P,CHIANG V L.A xylem-specific cellulose synthase gene from aspen（Populus tremuloides）is responsive to mechanical stress［J］.Plant J,2000,22（6）:495-502.

［3］ SUZUKI S,LI Laigeng,SUN Y H,et al.The cellulose synthase gene superfamily and biochemical functions of xylemspecific cellulose synthase-like genes in Populus trichocarpa［J］.Plant Physiol,2006,142（3）:1233-1245.

［4］ ENDLER A,PERSSON S.Cellulose synthases and synthesis in Arabidopsis［J］.Mol Plant,2011,4（2）:199-211.

［5］ RICHMOND T A,SOMERVILLE C R.The cellulose synthase superfamily［J］.Plant Physiol，2000，124（2）:495-498.

［6］ BURN J E,HOCART C H,BIRCH R J,et al.Functional analysis of the cellulose synthase genes CesA1,CesA2 and CesA3 in Arabidopsis［J］.Plant Physiol，2002，129（2）：797-807.

［7］ 陳鵬飛.白樺纖維素合成酶基因克隆與表達(dá)特征分析［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2008. CHEN Pengfei.Cloning of Cellulose Synthase Gene from Betula platyphylla and the Analysis of Their Expression Characteristic［D］.Harbin:Northeast Forestry University,2008.

［8］ SAMUGA A,CHANDRASHEKHAR P.A new cellulose synthase gene（PtrCesA2）from aspen xylem is orthologous to Arabidopsis AtCesA7（irx3）gene associated with secondary cell wall synthesis［J］.Gene,2002,296（1/2）:37-44.

［9］ KALLURI U C,JOSHI C P.Isolation and characterization of a new,full-length cellulose synthase cDNA,PtrCesA5 from developing xylem of Aspen trees［J］.J Exp Bot，2003，54（390）：2187-2188.

［10］ LIN Yen,KAO Yuying,CHEN Zenzong,et al.cDNA cloning and molecular characterization of five cellulose synthase a genes from Eucalyptus camaldulensis［J］.J Plant Biochem Biotechnol,2014,23（2）:199-210.

［11］ 蔣向輝，佘朝文，許棟，等.杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆與序列分析［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2009，29（6）：24-29. JIANG Xianghui,SHE Chaowen,XU Dong,et al.Partial cDNA cloning and sequence analysis of CCoAOMT gene of Cunninghamia lanceolata（lamb.）［J］.J Central South Univ For&Technol,2009,29（6）:24-29.

［12］ HUANG Huahong,XU Lili,TONG Zaikang,et al.De novo characterization of the Chinese fir（Cunninghamia lanceolata）transcriptome and analysis of candidate genes involved in cellulose and lignin biosynthesis［J］.BMC Genomics,2012,13（1）:648.

［13］ 呂運舟，鄭佳，陳金慧，等.參與杉木次生壁合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子ClMYB4的克隆及在大腸桿菌中表達(dá)［J］.分子植物育種，2012，10（5）：512-519. Lü Yunzhou,ZHENG Jia,CHEN Jinhui,et al.Cloning transcription factor ClMYB4 involving in secondary cell wall biosynthesis from Cunninghamia lanceolata （Lamb.）Hook and expressing in E.coli［J］.Mol Plant Breed,2012,10 （5）:512-519.

［14］ 彭沙沙，童再康，黃華宏，等.杉木纖維素合成酶類似蛋白基因CLCslD1的克隆及其生物信息學(xué)分析 ［J］.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2012，29（1）：1-6. PENG Shasha,TONG Zaikang,HUANG Huahong,et al.Clone and analysis of cellulose synthase-like protein D gene （CSLD）in Cunninghcunia lanceolata［J］.J Zhejiang A&F Univ,2012,29（1）:1-6.

［15］ TAMURA K,DUDLEY J,NEI M,et al.MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Mol Biol Evol,2007,24（8）:1596-1599.

［16］ TAYLOR N G,SCHEIBLE W R,CUTLER S,et al.The irregular xylem 3 locus of Arabidopsis encodes a cellulose synthase are required for secondary cell wall synthesis［J］.Plant Cell,1999,11（5）:769-779.

［17］ RANIK M,MYBURG A A.Six new cellulose synthase genes from Eucalyptus are associated with primary and secondary cell wall biosynthesis［J］.Tree Physiol,2006,26（5）:545-556.

［18］ 陳奮學(xué)，黃華宏，童再康，等.矮生杉木的解剖特性［J］.浙江林學(xué)院學(xué)報，2008，25（5）：619-623. CHEN Fenxue,HUANG Huahong,TONG Zaikang,et al.Anatomical characteristics of dwarf Cunninghamia lanceolata［J］.J Zhejiang A For Coll,2008,25（5）:619-623.

［19］ BEECKMAN T,PRZEMECK G K H,STAMATIOU G,et al.Genetic complexity of cellulose synthase a gene function in Arabidopsis embryogenesis［J］.Plant Physiol,2002,130（4）:1883-1893.

Isolation and expression analysis of cellulose synthase genes in Chinese fir（Cunninghamia lanceolata）

PANG Jing,TONG Zaikang,HUANG Huahong,LIN Erpei,LIU Qiongyao
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

In this study,two full-length cDNAs encoding cellulose synthase（CESA）were isolated from Chinese fir（Cunninghamia lanceolata）using RT-PCR and RACE technology,and their sequence lengths were 3 235 bp and 3 876 bp,respectively.They were named ClCesA1 and ClCesA2,and the corresponding GenBank accession numbers were JQ844574 and JQ844575 respectively.The encoded proteins are composed of 992 and 1 092 amino acids,with theoretical molecular weight of 111 845.3 and 123 105.7 D,whose isoelectric points are 6.04 and 6.65,respectively.Amino acid sequences contain typical motifs of plant CESA proteins:a ring finger domain,two class specific regions CSRI and CSRII,two conserved regions CRI and CRII,cellulose synthase substrate binding domain “D,D,D,QVLRW”,and eight transmembrane regions.The expression analysis showed that ClCesA1 and ClCesA2 genes exhibited the high transcript abundance in stem,the corresponding expression levels in mature xylem were higher than that in cortex.The two genes had the lower expression levels in root and leaf.The further expression analysis was conducted using the dwarf Chinese fir with the specific wood properties.The results showed that the expression levels of ClCesA1 and ClCesA2 in the xylem of normal fir were about 2-12 times than that of the dwarf.Two ClCesA genes may be play importantroles in the wood formation of Chinese fir.［Ch,5 fig.19 ref.］

forest tree breeding;Cunninghamia lanceolata;CesA gene;cloning;sequence analysis;expression analysis

S722.3；Q943

A

2095-0756（2015）01-0040-07

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報，2015，32（1）：40-46

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.01.006

2013-12-30；

2013-05-16

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（“863”計劃）項目（2011AA100203）；浙江省農(nóng)業(yè)科技重點項目（2012C12908-11，2011C12014）；浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林資源培育研究中心預(yù)研項目（CCSFR2013002）

龐景，從事林木遺傳育種研究，E-mail:294144351@qq.com。通信作者：童再康，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事林木遺傳育種研究。 E-mail：zktong@zafu.edu.cn