涂 浩，趙星燦，楊占娜，李夢輝，徐立新，嚴(yán)若峰，宋小凱，李祥瑞*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2.洛陽市動物疫病控制中心，洛陽 471002)

豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ對口蹄疫合成肽疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究

涂 浩1，趙星燦2，楊占娜1，李夢輝1，徐立新1，嚴(yán)若峰1，宋小凱1，李祥瑞1*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2.洛陽市動物疫病控制中心，洛陽 471002)

為了研究豬IL-2、IL-4和IFN-γ對口蹄疫合成肽疫苗的免疫佐劑效應(yīng)，將經(jīng)測定具有生物學(xué)活性的豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ與口蹄疫合成肽疫苗配伍免疫仔豬，檢測仔豬抗口蹄疫抗體水平和血清細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ含量的變化，觀察其免疫佐劑效應(yīng)。結(jié)果表明：制備的IL-2、IL-4和IFN-γ重組蛋白質(zhì)均有較好的生物學(xué)活性，其中IL-2和IFN-γ重組蛋白質(zhì)均能極顯著提高仔豬抗口蹄疫抗體水平(P<0.01)，而IL-4重組蛋白質(zhì)抑制口蹄疫抗體的產(chǎn)生(P<0.01)。血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)口蹄疫疫苗+IL-4組的IL-4和IL-10含量均較空白疫苗免疫豬顯著升高(P<0.05)，口蹄疫疫苗+IL-2組及口蹄疫疫苗+IFN-γ組的IFN-γ含量較空白疫苗免疫豬極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果提示，重組細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ分別作為免疫佐劑與口蹄疫疫苗聯(lián)用，能顯著增強(qiáng)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

重組蛋白質(zhì)；IL-2；IL-4；IFN-γ；佐劑效應(yīng)；口蹄疫

免疫接種常是控制傳染病的重要手段，然而傳統(tǒng)的疫苗接種存在多種安全問題，新型的亞單位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗等存在反應(yīng)性弱、免疫原性小，在體內(nèi)易降解等缺點(diǎn)，使得機(jī)體難以產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)力。因此免疫佐劑就成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一。細(xì)胞因子是機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞或免疫相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有廣泛生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，在機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫產(chǎn)生和調(diào)節(jié)過程中都發(fā)揮重要作用，是機(jī)體執(zhí)行免疫學(xué)功能不可缺少的成分[1]，相比傳統(tǒng)佐劑，作為免疫增強(qiáng)劑具有更多優(yōu)勢。

白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2)、白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)都是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)不可缺少的細(xì)胞因子，具有很高的研究價值[2]。IL-2能同時增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫，是一種天然的免疫增強(qiáng)劑和治療劑[3-5]；IFN-γ可增加抗原遞呈細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子的表達(dá)，對產(chǎn)生CTL應(yīng)答和提高IgG抗體水平有很大幫助[6-7]；IL-2和IFN-γ均屬于TH1型細(xì)胞因子，可顯著地協(xié)同促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖[8]；IL-4主要增強(qiáng)TH2反應(yīng)，有研究表明豬IL-4不同于鼠和人的IL-4，其不能誘導(dǎo)和刺激B細(xì)胞的分泌和生長，且抑制抗體的產(chǎn)生，同時抑制抗原刺激的B細(xì)胞增殖[9]。目前關(guān)于豬的重組細(xì)胞因子對豬口蹄疫疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究較少，為了明確IL-2、IL-4和IFN-γ的免疫增強(qiáng)作用，進(jìn)而開發(fā)新型、安全、高效的疫苗佐劑，本試驗(yàn)通過表達(dá)IL-2、IL-4和IFN-γ基因的重組蛋白質(zhì)作為疫苗的免疫佐劑，在實(shí)驗(yàn)動物上開展了這三種重組蛋白質(zhì)對豬口蹄疫合成肽疫苗免疫增強(qiáng)作用的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

21日齡健康仔豬30頭(口蹄疫抗體檢測陰性)，體重6.0 kg±0.5 kg，來自河南洛陽某豬場，品種包括長白、大白、杜洛克等。

1.2 試劑

口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所(批號：2014031901)；口蹄疫合成肽疫苗(批號：20131109)，由河南洛陽市畜牧工作站提供；細(xì)胞因子IL-4(貨號：CSB-E06785p)、IL-10(貨號：CSB-E06779p)、IL-17(貨號：CSB-E08057p)、IFN-γ(貨號：CSB-E06794p)檢測試劑盒購自武漢華美生物技術(shù)有限公司；RMPI1640(貨號：C11875500BT)、DMEM(貨號：C11320500BT)細(xì)胞培養(yǎng)液購自Life公司；外周血淋巴細(xì)胞分離液(貨號：LTS1077)購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；刀豆蛋白ConA(貨號：SLBD7276V)購自Sigma公司；Cell Counting Kit-8(編號：C0038)購自碧云天生物技術(shù)研究所；Easy Protein Quantitative Kit(貨號：DQ101-01H10403G008)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；豬IL-2、IL-4和IFN-γ基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-IL-2、pET32a-IL-4和pET28a-IFN-γ由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；水皰性口炎病毒(VSV)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 細(xì)胞因子重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建的重組原核表達(dá)菌pET28a-IL-2、pET32a-IL-4和pET28a-IFN-γ分別接種至含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后各按1∶100接種量轉(zhuǎn)接于500 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩搖菌至OD600 nm值達(dá)0.4～0.6時，加入終濃度為0.1 mmol·L-1的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，離心收集菌體，用STE緩沖液洗滌2次，再收集菌體，經(jīng)超聲波裂解，離心分離上清和包涵體。上述重組蛋白質(zhì)主要以包涵體形式存在，收集沉淀，用8 mol·L-1尿素溶解。

1.4 細(xì)胞因子重組蛋白質(zhì)的純化和復(fù)性

將8 mol·L-1尿素溶解的包涵體離心收集上清，用0.22 μm濾膜過濾除菌。按照如下步驟純化重組蛋白質(zhì)：先用10 mL雙蒸水清洗1 mL His-Trap純化柱，接著用10 mL的包涵體Binding Buffer(0.02 mol·L-1Na2HPO4、0.02 mol·L-1NaH2PO4、0.5 mol·L-1NaCl、0.02 mol·L-1咪唑、8 mol·L-1尿素)平衡純化柱，再將蛋白質(zhì)樣品過His-Trap純化柱，用10 mL包涵體Binding Buffer洗去雜蛋白質(zhì)，最后用5 mL的Elution Buffer(0.02 mol·L-1Na2HPO4、0.02 mol·L-1NaH2PO4、0.5 mol·L-1NaCl、0.5 mol·L-1咪唑、8 mol·L-1尿素)洗脫蛋白質(zhì)樣品。將收集的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳觀察純化情況。

采用透析復(fù)性法，將純化后的重組蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到透析袋中，依次在含有6、4、3、2、0 mol·L-1尿素復(fù)性緩沖液(0.02 mol·L-1Tris-Cl、0.5 mol·L-1NaCl、1 mmol·L-1GSH、0.1 mmol·L-1GSSG)中4 ℃條件下各透析12 h，后用無K+PBS中透析2次。最后經(jīng)聚乙二醇(PEG20000)包埋濃縮至適當(dāng)體積，過濾除菌后置-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞因子重組蛋白質(zhì)濃度測定及生物活性分析

1.5.1 重組IL-2、IL-4、IFN-γ蛋白質(zhì)濃度測定 復(fù)性后的重組蛋白質(zhì)濃度使用Easy Protein Quantitative Kit試劑盒，采用Bradford法[10]嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行測定。

1.5.2 重組IL-2、IL-4蛋白質(zhì)生物活性測定 無菌采取豬外周靜脈血，3.8%檸檬酸鈉抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC[11]。用RMPI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 μg·mL-1)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106個·mL-1，兩塊96孔板每孔加細(xì)胞懸浮液100 μL，依次分別加入豬IL-2和IL-4蛋白質(zhì)，使其終質(zhì)量濃度為5、10、20、40 μg·mL-1，每個梯度做5個重復(fù)，同時設(shè)細(xì)胞對照組、調(diào)零孔、空載體對照組和ConA對照組， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。增殖指數(shù)(SI)=試驗(yàn)組OD450 nm值/細(xì)胞對照組OD450 nm值。

1.5.3 重組IFN-γ蛋白質(zhì)生物活性測定 在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上用DMEM+10%FBS+1%雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)PK15細(xì)胞長成單層，吸棄培養(yǎng)液，分別接種100 μL用DMEM 培養(yǎng)液10倍梯度遞次稀釋的豬水皰性口炎病毒(VSV)，每個稀釋梯度重復(fù)8孔，同時作陰性對照，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)，連續(xù)3 d，然后按Reed-Muench法[12]計(jì)算VSV的TCID50。

測定濃度的可溶性重組IFN-γ蛋白質(zhì)用DMEM+2%FBS培養(yǎng)液作10倍稀釋，再進(jìn)行2倍遞次稀釋，按每孔0.1 mL的量加入PK15細(xì)胞長成單層的96孔培養(yǎng)板上，每個稀釋度重復(fù)8孔，37 ℃、5%的CO2條件誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液，用100 TCID50的VSV攻毒，同時設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察CPE，連續(xù)3 d。參照病毒毒價測定法，用病變抑制孔代替毒價的病變孔，按Reed-Muench法計(jì)算IFN-γ蛋白質(zhì)抗病毒活性單位。

1.6 重組細(xì)胞因子對口蹄疫疫苗免疫增強(qiáng)作用研究

試驗(yàn)選取3周齡健康仔豬30頭，隨機(jī)分成6組，每組5頭。設(shè)空白對照組(PBS)、口蹄疫疫苗組(Vaccine)、口蹄疫疫苗+IL-2組(Vaccine+IL-2)、口蹄疫疫苗+IL-4組(Vaccine+IL-4)、口蹄疫疫苗+IFN-γ組(Vaccine+IFN-γ)和口蹄疫疫苗+空載體組(Vaccine+pET28a/32a空載體蛋白質(zhì))。試驗(yàn)組在仔豬耳根后肌肉注射O型口蹄疫合成肽疫苗的同時，按照15 μg·kg-1劑量注射重組蛋白質(zhì)。于免疫后第0、14 、30 、60 、90 天豬頸部前腔靜脈采血分離血清，進(jìn)行O型口蹄疫抗體ELISA檢測和細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ的檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞因子重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、分布純化及復(fù)性

SDS-PAGE 電泳結(jié)果(圖1)顯示，攜帶pET28a-IL-2、pET32a-IL-4和pET28a-IFN-γ重組質(zhì)粒的陽性克隆菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，分別表達(dá)了相對分子質(zhì)量約為21.4、30.3和20.7 ku的目的蛋白質(zhì)，與預(yù)期的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小一致。蛋白質(zhì)的可溶性分析表明，三種重組蛋白質(zhì)均呈不可溶表達(dá)，在菌體內(nèi)主要以不溶性的包涵體形式存在，用鎳離子親和層析法對其進(jìn)行純化后電泳，出現(xiàn)較清晰單一的特異性條帶。

2.2 細(xì)胞因子重組蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定和生物活性分析

2.2.1 重組蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定 采用Bradford法測定復(fù)性濃縮后的可溶性重組蛋白質(zhì)，根據(jù)試劑盒中BSA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到重組IL-2蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.675 mg·mL-1，IL-4蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.751 mg·mL-1，IFN-γ蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.205 mg·mL-1。

2.2.2 重組IL-2、IL-4蛋白質(zhì)生物活性測定 由表1可知，重組蛋白質(zhì)IL-2在體外能刺激豬外周血淋巴細(xì)胞的增殖，并且增殖效果與蛋白質(zhì)劑量有一定關(guān)系，在適宜蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度條件下，隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度增大，增殖效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1時，增殖效果最明顯。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.表達(dá)的IL-2包涵體蛋白；2.純化的IL-2包涵體蛋白；3.復(fù)性后IL-2包涵體蛋白；4.表達(dá)的IL-4包涵體蛋白；5.純化的IL-4包涵體蛋白；6.復(fù)性后IL-4包涵體蛋白；7.表達(dá)的IFN-γ包涵體蛋白；8.純化的IFN-γ包涵體蛋白；9.復(fù)性后IFN-γ包涵體蛋白M.Protein marker；1.The sediment of IL-2；2.Purified IL-2 protein；3.Renatured IL-2 protein；4.The sediment of IL-4；5.Purified IL-4 protein；6.Renatured IL-4 protein；7.The sediment of IFN-γ；8.Purified IFN-γ protein；9.Renatured IFN-γ protein圖1 IL-2、IL-4和IFN-γ表達(dá)產(chǎn)物沉淀純化復(fù)性SDS-PAGE電泳分析Fig.1 Expressed IL-2，IL-4 and IFN-γ products sediment purification and renaturation analysis by SDS-PAGE

表1 重組蛋白質(zhì)IL-2對豬外周血淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)

Table1 Effect of recombinant protein IL-2 on proliferation of lymphocyte

組別GroupOD450nmOD450nmvalue增殖指數(shù)(SI)Proliferationindex(SI)細(xì)胞對照0．2977±0．0064—5μg·mL-1IL?20．3437±0．0022??1．154510μg·mL-1IL?20．4288±0．0130??1．440420μg·mL-1IL?20．4008±0．0088??1．346340μg·mL-1IL?20．3462±0．0050??1．1629pET28a空載體蛋白質(zhì)0．3020±0．00931．0144ConA單獨(dú)刺激0．5650±0．0033??1．89791640培養(yǎng)液0．0000±0．0000—

*表示與細(xì)胞對照組比較差異顯著(P<0.05)；**表示與細(xì)胞對照組比較差異極顯著(P<0.01)。下表同

* indicateP<0.05 between the experimental group and cell control group，respectively；** indicateP<0.01 between the experimental group and cell control group，respectively.The same as below

由表2可知，雖然重組蛋白質(zhì)IL-4刺激豬外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，當(dāng)IL-4終質(zhì)量濃度為10和20 μg·mL-1時差異顯著，但增殖指數(shù)變化很小。

2.2.3 重組IFN-γ蛋白質(zhì)生物活性測定 逐日觀察10倍梯度稀釋的VSV在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上致細(xì)胞病變結(jié)果，如表3所示，可知病毒株的TCID50在10-6(70%)和10-7(18.2%)之間，根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算得VSV在PK15細(xì)胞中的TCID50為10-6.38·0.1 mL-1。而10倍稀釋后再2倍遞次稀釋的重組豬IFN-γ蛋白質(zhì)在PK15細(xì)胞上抑制水皰性口炎病毒復(fù)制的結(jié)果見表4，參照病毒毒價計(jì)算法計(jì)算IFN-γ活性為(64.71-50)/(64.71-37.5)=54.06%，其在PK15細(xì)胞上抗VSV活性為(10×24.540 6/0.1 mL)/0.205 mg·mL-1=1.135×104U·mg-1。

表2 重組蛋白質(zhì)IL-4對豬外周血淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)

Table2 Effect of recombinant protein IL-4 on proliferation of lymphocyte

組別GroupOD450nmOD450nmvalue增殖指數(shù)(SI)Proliferationindex(SI)細(xì)胞對照0．2522±0．0072—5μg·mL-1IL?40．2562±0．00301．015910μg·mL-1IL?40．2678±0．0049??1．061920μg·mL-1IL?40．2598±0．0050?1．030140μg·mL-1IL?40．2491±0．00290．9877pET32a空載體蛋白質(zhì)0．2550±0．00821．0111ConA單獨(dú)刺激0．5235±0．0078??2．07571640培養(yǎng)液0．0000±0．0000—

表3 VSV致細(xì)胞病變結(jié)果

Table 3 Cytopathic effect caused by VSV

表4 重組蛋白質(zhì)IFN-γ抗VSV活性測定

Table 4 Recombinant protein IFN-γ inhibited cytopathogenic effect in VSV

IFN?γ稀釋度DilutionofIFN?γ(10×)接種細(xì)胞孔數(shù)Numberofinoculation出現(xiàn)CPE孔WellswithCPE不出現(xiàn)CPE孔WellswithoutCPE累計(jì)總數(shù)Total有CPE孔WellswithCPE無CPE孔WellswithoutCPE細(xì)胞孔總數(shù)Totalwells細(xì)胞病變保護(hù)率/%CPErestrainrate2180803232100228171242596238263172085248356111764．71258441061637．50268621621811．112788024024028880320320攻毒對照8808080陰性對照808088100

2.3 重組細(xì)胞因子對口蹄疫抗體水平的增強(qiáng)效果

采用口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒檢測重組蛋白質(zhì)IL-2、IL-4、IFN-γ的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果如圖2所示，可知免疫后第0—30天，各疫苗免疫組O型口蹄疫抗體水平有明顯的上升，其中第14—30天，IL-2組、IFN-γ組與疫苗對照組、空載體蛋白質(zhì)組相比，差異極顯著(P<0.01)，且IL-2組抗體上升水平略高于IFN-γ組；而IL-4組在免疫后第30天的檢測結(jié)果顯示其不僅不能促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，反而抑制其產(chǎn)生(P<0.01)；空載體蛋白質(zhì)組與疫苗對照組相比，抗體水平差異不顯著(P>0.05)。在免疫后第30天，各免疫組的口蹄疫抗體水平開始下降，但I(xiàn)L-2組的抗體下降水平低于空載體蛋白質(zhì)組與疫苗對照組。

試驗(yàn)組與同一時間疫苗對照組之間，*.P<0.05；**.P<0.01。下圖同Between the experimental group and the vaccine control group at the same time，*.P<0.05；**.P<0.01.The same as below圖2 不同免疫組抗O型FMD抗體滴度變化Fig.2 Changes of antibody titers against serotype O in different groups after immunization

2.4 細(xì)胞因子重組蛋白質(zhì)對仔豬血清細(xì)胞因子含量變化的影響

2.4.1 細(xì)胞因子重組蛋白質(zhì)對仔豬血清細(xì)胞因子IL-4含量變化的影響 免疫仔豬血清IL-4的檢測結(jié)果如圖3A所示，仔豬免疫后第14、30天，各免疫組與免疫前相比，均檢測到IL-4水平的上升，且差異極顯著(P<0.01)，免疫前各組IL-4含量差異不顯著(P>0.05)。免疫后第14天檢測結(jié)果表明，IL-4組的IL-4水平顯著高于疫苗對照組(P<0.05)，而其余各免疫組與疫苗對照組相比，差異不顯著(P>0.05)。免疫后第30天，IL-2組與疫苗對照組相比，IL-4濃度降低，差異顯著(P<0.05)；IFN-γ組與疫苗對照組相比，IL-4水平也降低，且差異極顯著(P<0.01)。

2.4.2 細(xì)胞因子重組蛋白質(zhì)對仔豬血清細(xì)胞因子IL-10含量變化的影響 免疫仔豬血清IL-10的檢測結(jié)果如圖3B所示，仔豬免疫后第14天，各免疫組與免疫前相比，均檢測到IL-10水平的上升，在第14天時濃度達(dá)到最高值，隨后濃度開始降低，且差異顯著(P<0.05)，免疫后第30天，疫苗組、IL-4組與免疫前相比差異顯著，而IL-2組、IFN-γ組、空載體蛋白質(zhì)組與免疫前相比差異不顯著(P>0.05)，且免疫第0天各組IL-10水平差異不顯著。免疫后第14天檢測結(jié)果表明，各免疫組間IL-10含量差異不顯著(P>0.05)。免疫后第30天，僅IL-4組的IL-10含量顯著高于疫苗對照組(P<0.05)。

2.4.3 細(xì)胞因子重組蛋白質(zhì)對仔豬血清細(xì)胞因子IL-17含量變化的影響 免疫仔豬血清IL-17的檢測結(jié)果如圖3C所示，仔豬免疫后第14、30天，各免疫組與免疫前相比，IL-17含量差異不顯著(P>0.05)，各免疫組IL-2、IL-4及空載體蛋白質(zhì)組與疫苗對照組相比差異不顯著(P>0.05)，僅IFN-γ組在第30天檢測結(jié)果與疫苗對照組相比，差異顯著(P<0.05)。由圖可看到IL-4組及IFN-γ組在第30天檢測到IL-17濃度的降低。

2.4.4 細(xì)胞因子重組蛋白質(zhì)對仔豬血清細(xì)胞因子IFN-γ含量變化的影響 免疫仔豬血清IFN-γ的檢測結(jié)果如圖3D所示，仔豬免疫后第14、30天，各免疫組與免疫前相比，均檢測到血清IFN-γ水平的上升，且差異極顯著(P<0.01)，免疫第0天，各組之間IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)。免疫后第14天的檢測結(jié)果表明，各免疫組IL-2、IL-4、IFN-γ與疫苗對照組相比，IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)。免疫后第30天，IL-2組及IFN-γ組的IFN-γ水平均極顯著高于疫苗對照組(P<0.01)，而IL-4組及空載體蛋白質(zhì)組與疫苗對照組相比，IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

細(xì)胞因子是動物體內(nèi)特異高效調(diào)控免疫細(xì)胞和協(xié)調(diào)免疫應(yīng)答最重要的信號分子，具有較強(qiáng)的免疫佐劑效應(yīng)，既可增強(qiáng)抗原的免疫原性，又可作用于體內(nèi)免疫細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化，加強(qiáng)其活性與功能，影響細(xì)胞內(nèi)生物活性分子的表達(dá)與分泌。在本試驗(yàn)中，將經(jīng)鑒定具有良好生物學(xué)活性的豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ與口蹄疫疫苗聯(lián)合免疫仔豬，結(jié)果表明重組細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ能顯著促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)口蹄疫抗體的產(chǎn)生，而IL-4不僅不能促進(jìn)口蹄疫抗體產(chǎn)生，反而抑制機(jī)體的體液免疫應(yīng)答。

圖3 試驗(yàn)仔豬免疫后血清細(xì)胞因子含量變化Fig.3 Change of the content of cytokines in the sera of experimental pigs after vaccination

IL-2是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，具有多種免疫調(diào)節(jié)作用，可以活化NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化和分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體[13-14]，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。T細(xì)胞可分成兩大亞群：即CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。TH細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個重要亞群，在IL-2、IFN-γ等微環(huán)境中向TH1細(xì)胞分化，TH1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-2等可提供進(jìn)行性信號，引起B(yǎng)細(xì)胞增殖、分化，形成漿細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞，發(fā)生類轉(zhuǎn)換，并分泌抗體[2]。H.T.Wong等[15]發(fā)現(xiàn)IL-2可增強(qiáng)機(jī)體對FMDV感染的免疫應(yīng)答；Y.Lin等[16]發(fā)現(xiàn)豬IL-2重組蛋白質(zhì)與偽狂犬病毒疫苗聯(lián)用可以顯著增強(qiáng)抗體的產(chǎn)生和CTL細(xì)胞活性；G.Rompato等[17]用IL-2質(zhì)粒與PRRSV疫苗共同免疫豬時發(fā)現(xiàn)其可明顯增強(qiáng)機(jī)體對PRRSV感染的細(xì)胞免疫和體液免疫的功能。CCK-8試劑盒檢測結(jié)果證明本實(shí)驗(yàn)室制備的豬重組IL-2蛋白質(zhì)具有良好的生物學(xué)活性，能顯著刺激豬外周血淋巴細(xì)胞增殖。而重組蛋白質(zhì)對FMDV抗體水平增強(qiáng)效果的結(jié)果也表明IL-2蛋白質(zhì)能促進(jìn)機(jī)體B細(xì)胞增殖和抗體生成，提高對疫苗的應(yīng)答能力，與上述研究結(jié)果一致。在進(jìn)行細(xì)胞因子檢測時發(fā)現(xiàn)，IL-2組的IFN-γ含量相對高于疫苗對照組，而IL-4、IL-10含量相對降低，可能是因?yàn)镮L-2可誘導(dǎo)TH細(xì)胞發(fā)生TH1型極化反應(yīng)，促使TH1細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ，IL-2和IFN-γ可通過上調(diào)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子及黏膜分子的表達(dá)，促進(jìn)CTL活化可產(chǎn)生大量IFN-γ，后者也可通過APC分泌IL-2。

IL-4是1982年發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌，肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞也可合成分泌。IL-4在調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的分化、活化，促進(jìn)以TH2細(xì)胞為特征的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有研究表明，豬IL-4不同于鼠和人的IL-4，不但不能誘導(dǎo)和刺激B細(xì)胞的增殖，而且抑制抗體的產(chǎn)生和IL-6的分泌[9,18]；G.Rompato等[17]也發(fā)現(xiàn)用IL-4質(zhì)粒與PRRSV DNA疫苗聯(lián)用時發(fā)現(xiàn)豬IL-4不能促進(jìn)機(jī)體對PRRSV感染的應(yīng)答，反而抑制機(jī)體抗體的產(chǎn)生。IL-4、TNF、lipopolysaccharide(LPS)等均能誘導(dǎo)豬IL-4的合成[19]。本試驗(yàn)中用CCK-8試劑盒檢測IL-4促豬淋巴細(xì)胞增殖差異顯著可能是由于豬IL-4不能刺激T細(xì)胞增殖，但能誘導(dǎo)細(xì)胞的生長且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，而對于B細(xì)胞可能是豬IL-4不能傳遞增殖信號卻遞呈了生存信號，能夠短暫刺激細(xì)胞的分裂[9]。本試驗(yàn)的疫苗佐劑效應(yīng)結(jié)果與上述報道一致，發(fā)現(xiàn)豬IL-4重組蛋白質(zhì)與口蹄疫疫苗共同免疫豬后不能促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答和抗體產(chǎn)生。目前，對于IL-4抑制免疫應(yīng)答的機(jī)制仍不明確，有報道闡釋是IL-4作用于樹突狀細(xì)胞(DC)的基部而減弱溶細(xì)胞性T細(xì)胞的應(yīng)答，IL-4阻止抗原刺激白細(xì)胞毒性前體物質(zhì)促樹突細(xì)胞分化的過程，從而影響DC對CD8+T細(xì)胞的活化。該調(diào)節(jié)的分子基礎(chǔ)DC表面的B7-1/B7-2，研究發(fā)現(xiàn)B7-2能誘使CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增，B7-1控制其溶細(xì)胞活性的獲得[20]；也有猜想認(rèn)為豬IL-13有與其他種屬動物IL-4相似的功能[21]，這兩基因位于同一染色體上，而且鼠IL-4基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位與豬IL-13基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位相似，鼠IL-13基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位與豬IL-4基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位相似[9]。

IFN-γ是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其生物學(xué)效應(yīng)具有高度的種屬特異性。IFN-γ是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，以上調(diào)MHC分子的表達(dá)，促進(jìn)抗原遞呈為最主要的免疫調(diào)節(jié)活性，增強(qiáng)APC與T細(xì)胞相互作用；還可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表面表達(dá)Fc受體，有利于對抗原的吞噬，K、NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷以及T、B淋巴細(xì)胞的激活，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力；IFN-γ不僅是TH1分泌的效應(yīng)因子，而且對TH1/ TH2分化具有重要調(diào)節(jié)作用，可以促使CD4+TH細(xì)胞向TH1細(xì)胞的極化，并刺激IL-2、IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子的上調(diào)，起到免疫系統(tǒng)活化的效果[22]。因此，IFN-γ成為新型免疫佐劑中的研究熱點(diǎn)。G.M.Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)用構(gòu)建的重組質(zhì)粒PCV2-ORF2-IFN-γ免疫小鼠后可促進(jìn)機(jī)體PCV2-ORF2特異性抗體的產(chǎn)生；Y.P.Wang等[23]也發(fā)現(xiàn)IFN-γ質(zhì)粒與PCV2-Cap 蛋白質(zhì)共免疫可增強(qiáng)機(jī)體的抗體水平和淋巴細(xì)胞的增殖；A.Summerfield等[24]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV對干擾素很敏感，IFN-α對動物機(jī)體和細(xì)胞的FMDV有明顯的抑制效應(yīng)，IFN-γ能活化NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，阻止病毒復(fù)制；M.P.Moraes等[25]和S.M.Kim等[26]也先后證實(shí)Ⅰ型和Ⅱ型干擾素的協(xié)同使用能抑制FMDV的復(fù)制，增強(qiáng)機(jī)體對FMDV感染的免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)中IFN-γ重組蛋白質(zhì)抗VSV活性結(jié)果表明制備的IFN-γ蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的抗病毒作用，其主要是通過誘導(dǎo)一些目的基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，這些目的基因表達(dá)產(chǎn)物主要是一些參與病毒RNA降解和剪切的酶或蛋白質(zhì)。IFN-γ對口蹄疫疫苗免疫增強(qiáng)效果的結(jié)果也與上述報道一致，說明IFN-γ可特異性地增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，使機(jī)體獲得有效的保護(hù)。細(xì)胞因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ組IL-17含量的下降可能是由于IFN-γ可以干擾TGF-β1誘導(dǎo)的TH17細(xì)胞分化過程[27]，同時檢測到IL-4含量的下降可能是由于干擾素通過抑制STAT6活性來減少IL-4基因表達(dá)[28]。

細(xì)胞因子是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，各種細(xì)胞借助于自己分泌的細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)各自的功能，細(xì)胞因子水平的高低，可以直接或間接反映免疫細(xì)胞或免疫應(yīng)答狀態(tài)[29]。然而，靜息期細(xì)胞通常不表達(dá)細(xì)胞因子，細(xì)胞因子的產(chǎn)生，有賴于抗原的刺激，刺激消失，細(xì)胞因子的分泌也逐漸停止，其作用也逐步減弱[30]。本研究中，分別于免疫后第14、30天檢測細(xì)胞因子水平，目的是為了觀察免疫應(yīng)答狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫后第14天和30天細(xì)胞因子水平依然較高，說明疫苗抗原在動物體內(nèi)存在時間較長，能夠在較長時間內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。

4 結(jié) 論

豬重組細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ作為免疫佐劑與口蹄疫疫苗聯(lián)合免疫后能夠顯著加強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，這為研究新型高效安全的免疫增強(qiáng)劑提供了依據(jù)，而對IL-4抑制機(jī)體抗體產(chǎn)生的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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(編輯 白永平)

Immunological Enhancement of Recombinant Porcine IL-2，IL-4 and IFN-γ on Foot-and-mouth Disease Synthetic Peptide Vaccine

TU Hao1，ZHAO Xing-can2，YANG Zhan-na1，LI Meng-hui1，XU Li-xin1， YAN Ruo-feng1，SONG Xiao-kai1，LI Xiang-rui1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China； 2.CenterforAnimalDiseaseControlandPreventionofLuoyangCity，Luoyang471002，China)

The current study was undertaken to certify the immunological adjuvant effect of recombinant IL-2，IL-4 and IFN-γ of porcine on the foot-and-mouth disease synthetic peptide vaccine.The changes of antibody and IL-4，IL-10，IL-17 and IFN-γ levels of porcines injected with synthetic peptide vaccine against foot-and-mouth disease and recombinant IL-2，IL-4 and IFN-γ of porcine，respectively.The results showed that the recombinant protein we made all had good biological activity.IL-2 and IFN-γ protein significantly increased the level of antibody against foot-and-mouth disease (P<0.01)，while IL-4 appeared to have a suppressive effect (P<0.01).Recombinant IL-4 significantly enhanced IL-4 and IL-10 secretions compared with that of the vaccine control group (P<0.05).The IL-2 and IFN-γ could significantly stimulate the production of IFN-γ (P<0.01).These results indicated that IL-2 and IFN-γ of porcine could significantly enhance the immune response against FMDV respectively.

recombinant protein；IL-2；IL-4；IFN-γ；adjuvant effect；foot-and-mouth disease

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.015

2014-11-17

十二五“863”計(jì)劃(2011AA10A211)家畜口蹄疫新型疫苗研制與生產(chǎn)工藝創(chuàng)新子課題偶蹄動物用新型免疫佐劑創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化和江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項(xiàng)目(PAPD)資助

涂 浩(1990-)，男，安徽舒城人，碩士，主要從事動物細(xì)胞因子克隆與應(yīng)用研究，E-mail：2012107053@njau.edu.cn

*通信作者：李祥瑞，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事寄生蟲分子與免疫、動物細(xì)胞因子的基因克隆與應(yīng)用和獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究，Tel：025-84399000，E-mail：lixiangrui@njau.edu.cn

S858.285.3

A

0366-6964(2015)08-1390-10