吳茜紅，張明月，楊文志，吳國江，李世杰

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定071000）

基因組印記（Genomic imprinting）是一種非孟德爾遺傳現(xiàn)象，是由于來自親本雙方的等位基因不對稱表觀遺傳修飾而造成的，基因表達具有親本特異性［1］。DNA甲基化是基因組印記的一種主要調(diào)控方式?；蚪M印記與生物進化、動物生長發(fā)育以及腫瘤發(fā)生都有密切關(guān)系。印記基因的研究主要集中在人類和鼠中，被鑒定的印記基因已經(jīng)超過220個（http：／／igc.otago.ac.nz／home.html）；而在牛中，由于缺少序列及多態(tài)性信息，被鑒定的印記基因只有20個。

Wnt抑制因子1（Wnt inhibitory factor 1，Wif1）是無翼信號通路（Wingless－type，Wnt）的胞外抑制蛋白，可直接和 Wnt蛋白結(jié)合，從而抑制Wnt信號的傳導(dǎo)。Wnt信號通路具有傳遞生長刺激信號的作用，該通路的異常激活可引起細胞異常增殖、分化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［2］。Wif1基因首先在人的視網(wǎng)膜組織中發(fā)現(xiàn)，在人的胚胎滋養(yǎng)層中表現(xiàn)為一個父源表達的印記基因［3－4］。定位于人12號染色體。而在牛中，其印記狀態(tài)和調(diào)控的分子機理還沒有被研究。本研究在分析Wif1基因在牛不同組織中印記狀態(tài)的基礎(chǔ)上，對Wif1基因啟動子區(qū)等位基因特異的甲基化狀態(tài)進行了分析，以期為豐富?；蚪M印記及揭示W(wǎng)if1基因印記的調(diào)控分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

32頭成年的荷斯坦奶牛（Holstein）的組織樣本，包括心、肝、脾、肺、腎、骨骼肌、皮下脂肪等組織采自當(dāng)?shù)赝涝讏?，裝入編號的采樣袋中，立即投入液氮，－70℃冰箱保存，以備后續(xù)試驗用。

1.2 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

利用TRIzol試劑盒提取3頭牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織的總RNA，用無RNA酶的DNase－Ⅰ去除可能的DNA污染，－70℃保存?zhèn)溆谩＠肨ransGen反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransGen，China）進行cDNA的合成。20μL反應(yīng)體系中含有大約4μg的RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序按廠家提供的產(chǎn)品說明書進行，體系加好后輕輕混勻，65℃ 變性10min，打開RNA的二級結(jié)構(gòu)，然后在每個反應(yīng)體系中加入1μL的 EasyScriptTM RT／RI Enzyme Mix，42℃孵育30min，70℃保溫15min，終止反應(yīng)，cDNA于－20℃保存待用。

1.3 Wif1基因在不同組織中的表達譜分析

RT－PCR用來檢測Wif1基因在牛組織中的表達模式。依照Wif1基因序列（GenBank accession No.NM＿001075996.1），設(shè)計牛Wif1基因的特異性引 物 Wif－1F （5′－CCAACAAATGCCAGTG－3′）和 Wif－1R （5′－TCAAGCCAATGCCAAC－3′）用 于擴增812bp跨內(nèi)含子的片段。利用GAPDH（GenBank accession No.BTU85042）跨內(nèi)含子的引物 Gapdh－F（5′－GCACAGTCAAGGCAGAGAAC－3′）和 Gapdh－R（5′－GCGTGGACAGTGGTCATAAG－3′）擴增367bp大小的片段作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為25μL：上下游引物（10μmol·L－1）各1μL，0.5μL cDNA 模板，10μL 雙蒸水和12.5μL ES Tap MasterMix（CWBio，China）。擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，44℃退火30s，72℃延伸35s，35個循環(huán)；72℃總延伸10min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，膠回收后送華大基因公司測序。

1.4 雜合子個體篩選

利用苯仿抽提法提取32頭荷斯坦奶牛肝組織的 DNA。 引 物 Wif－2F （5′－CCCACCTGAATCCAAT－3′）和 Wif－2R （5′－TCAAGCCAATGCCAAC－3′）擴增667bp DNA片段，通過PCR產(chǎn)物直接測序法尋找SNP，篩選雜合子。除0.5μL DNA作為模板外，其他PCR反應(yīng)體系同1.3RT－PCR。擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，44℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃總延伸10min。PCR產(chǎn)物純化后送華大基因公司測序。

1.5 Wif1基因的印記狀態(tài)分析

被鑒定為雜合子的動物用于等位基因特異的表達狀態(tài)分析。提取雜合子牛組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA、RNA提取和反轉(zhuǎn)錄程序同1.2，用得到的cDNA為模板，引物 Wif－1F和 Wif－1R擴增目的片段，將PCR產(chǎn)物膠回收后直接進行測序。

1.6 Wif1基因啟動子區(qū)CpG島預(yù)測及雜合子篩選

通過 MethPrimer 在 線 軟 件 （http：／／www.urogene.org／methprimer），預(yù)測牛Wif1基因第一外顯子及上游1kb序列上的CpG島（Criteria used：Island size＞100，GC Percent＞50.0，Obs／Exp＞0.6）。為了尋找啟動子區(qū)的雜合位點，設(shè)計引物 Wif1－3F（5′－AACCCTCTGACCGTTGTG－3′）和 Wif1－3R （5′－GGCATTTGGGAAGAAGTAG－3′）擴增32頭牛DNA。PCR反應(yīng)體系為25μL：0.5μL DNA模板，上下游引物（10μmol·L－1）各1 μL，10μL 雙蒸水和12.5μL ES Tap MasterMix（CWBio，China）。擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。膠回收PCR產(chǎn)物后直接進行測序。得到的雜合子用于等位基因特異的甲基化分析。

1.7 亞硫酸氫鹽處理、引物設(shè)計及PCR擴增

按照DNA甲基化試劑盒（Zymo，USA）說明書，將1.6中篩選到的雜合子牛的約500ng肺和肝組織DNA進行亞硫酸氫鹽處理。利用在線軟件（http：／／www.urogene.org／methprimer），針 對Wif1基因亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換后的DNA序列設(shè)計甲基 化 特 異 性 引 物 （BSP）Wif1－MF（5′－TTGGTTAGAGGTAGCGTAAGT－3′）和 Wif1－MR （5′－AACCTCTTAACTCTAATACGAAT－3′）擴增Wif1基因啟動子區(qū)410bp片段。反應(yīng)體系為25μL：1μL亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換后的DNA模板，上下游引物（10 μmol·L－1）各1μL，9.5μL雙蒸水和12.5μL ES Tap MasterMix（CWBio，China）。擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍后，取1μL作為第二輪模板。第二輪PCR的引物、體系和擴增條件與第一輪相同。將第二輪PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

1.8 克隆、DNA測序和數(shù)據(jù)分析

利用DNA 回收試劑盒（Cwbio，China）對1.7中第二輪擴增產(chǎn)物進行膠回收，純化后的片段與pMD19－T載體連接，轉(zhuǎn)化后涂板培養(yǎng)。每一個體各挑取18～22個單一的陽性克隆送華大科技公司測序。計算每一個體中mCpG占全部CpG的百分比。SPSS軟件分析等位基因間甲基化水平的差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 Wif1基因在不同組織中的表達

RT－PCR用于分析Wif1基因在牛7個組織中的表達，包括心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪。引物Wif－1F和 Wif－1R擴增來自3頭牛組織的RNA，GAPDH基因作為內(nèi)參。結(jié)果在7個被檢測的組織中，Wif1基因均擴增得到812bp大小的條帶（圖1），測序驗證為目的產(chǎn)物，表明Wif1基因在被檢測的組織中均表達。

圖1 牛Wif1基因各個組織中的RT－PCR結(jié)果Fig.1 RT－PCR results of Wif1gene from different tissues of cattle

2.2 Wif1基因雜合子個體篩選

用位于Wif1基因外顯子8上的引物 Wif－2F和Wif－2R擴增來自32頭牛肝組織的DNA，得到667bp的DNA片段，PCR產(chǎn)物回收后直接測序（圖2），發(fā)現(xiàn)一個A／C雜合位點，位于該基因的第1 759個核苷酸處（c.1759A＞C），鑒定的雜合子牛用于印記狀態(tài)分析。

2.3 Wif1基因印記狀態(tài)分析

圖2 牛DNA測序法確定Wif1基因的雜合子個體Fig.2 Identification of an SNP （A／C）in the bovine Wif1gene by sequencing

通過比較雜合子動物中g(shù).1759A＞C SNP位點在DNA PCR和RT－PCR產(chǎn)物直接測序的峰圖來確定印記基因的表達狀態(tài)。提取3頭g.1 7 5 9A＞C SNP位點為雜合的動物的組織RNA，RT－PCR產(chǎn)物直接測序，SNP位點附近峰圖見圖3，發(fā)現(xiàn)Wif1基因只有在肺中為單等位基因表達（單峰），說明Wif1基因在肺中是印記的；而在心、肝、脾、腎、肌肉、脂肪中為雙等位基因表達（雙峰），說明Wif1基因在檢測的6個組織中是非印跡的。

圖3 測序法分析Wif1基因等位基因特異性的表達模式Fig.3 Allele－specific expression analysis of Wif1gene in cattle by sequencing directly

2.4 Wif1等位基因特異的甲基化狀態(tài)分析

為了確定DNA甲基化在Wif1基因組織特異性印記中的可能作用，分析了Wif1基因啟動子區(qū)在單等位基因表達的組織（肺）和雙等位基因表達的組織（肝）中的等位基因特異的甲基化狀態(tài)。用位于Wif1基因啟動子區(qū)的引物 Wif－3F和 Wif－3R擴增來自32頭牛肝組織的DNA，PCR產(chǎn)物回收后直接測序，發(fā)現(xiàn)一個A／G雜合位點，位于該基因的第115個核苷酸處（g.115A＞G），g.115A＞G SNP位點用于區(qū)分等位基因的兩條鏈。用甲基化特異引物（Wif1－MF和 Wif1－MR）擴增包括g.115A＞G在內(nèi)的Wif1基因啟動子416bp的區(qū)域，包括了29個CpG位點，軟件預(yù)測每個CpG位點上可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的位點，發(fā)現(xiàn)其中14個CpG位點（第1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、15、18、24和25）上存在的7種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的位點（圖4），即ATF（TGACGT）、CREB（KWCGTCA）、GCF （SCGSSSC）、AP2（CCCMNSSS）、SP1 （GGCGGG）、HSV＿IE＿repeat（GCGGAA）、EIIaE－A（AAGGGCGC）。

分析3頭雜合子牛（7號、25號和32號）肝和肺組織中等位基因特異的甲基化狀態(tài)。根據(jù)在SNP位點的堿基命名來自親本等位基因的兩條鏈，分別為G－鏈和A－鏈（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在單等位基因表達的肺中，兩條親本鏈G－鏈和A－鏈的平均甲基化水平分別為38%和41%，差異不顯著（P＞0.05）；在雙等位基因表達的肝中，G－鏈（42%）和 A－鏈（38%）的平均甲基化水平也無顯著差異（P＞0.05）。進一步對肺和肝中每個CpG位點兩條親本鏈G－鏈和A－鏈之間的平均甲基化率進行差異顯著性分析 （圖6），發(fā)現(xiàn)在肺中有10個CpG位點A鏈與G鏈甲基化率存在顯著差異，其中第2、7、13、17個CpG位點差異極顯著（P＜0.01），第1、6、9、19、23、29個CpG位點的差異顯著（P＜0.05）；在雙等位基因表達的肝中，有4個CpG位點A鏈與G鏈甲基化率存在顯著差異，其中第7個CpG位點差異極顯著（P＜0.01），第13、23、和29個CpG位點差異顯著（P＜0.05）。與肝相比，肺中8個CpG位點（第1、2、6、9、17、19、23和29）兩條親本鏈甲基化率存在顯著差異，其中3個CpG位點（第1、2和6）位于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點上，由于單個CpG位點的甲基化變化會影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，推測這3個CpG位點的甲基化可能參與調(diào)控Wif1基因的組織特異性印記。

3 討 論

WIF1是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，通過與Wnt蛋白直接結(jié)合抑制Wnt信號通路，從而抑制癌細胞的干性并且促使癌細胞老化。本研究分析了Wif1基因在牛7個組織中mRNA轉(zhuǎn)錄情況、印記狀態(tài)以及啟動子區(qū)DNA甲基化的狀態(tài)。

Wif1基因的表達因物種、發(fā)育階段而有差異。J.C.Hsieh等［3］在蟾蜍胚胎發(fā)育的神經(jīng)胚期檢測到了Wif1基因的mRNA，而在蟾蜍和斑馬魚的胚胎原腸胚期未能檢測到Wif1基因的表達。Wif1基因在成年小鼠的心臟和肺臟中強表達，而在腦和眼中表達水平較低。D.D.Hunter等［5］發(fā)現(xiàn)在人的視網(wǎng)膜、軟骨、肺和大腦內(nèi)Wif1顯著表達；Wif1分布在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的很多不同區(qū)域，其中丘腦和嗅球內(nèi)表達顯著。C.Wissmann等［6］使用多克隆抗體的免疫組織化學(xué)分析顯示，在前列腺、乳腺、肺和膀胱的正常上皮細胞核周細胞質(zhì)Wif1高表達。本研究以RT－PCR方法分析了牛中Wif1基因在心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織中mRNA的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)Wif1基因在7個被測組織中均表達。研究結(jié)果表明，Wif1基因在多個物種中廣泛表達于多種組織中。

圖4 甲基化分析的Wif1基因啟動子區(qū)及預(yù)測的每個CpG位點上的轉(zhuǎn)錄因子Fig.4 The promoter region of Wif1gene analysed by bisulfite sequencing and the transcription factors predicted on each CpG sites

大部分印記基因在哺乳動物的胚胎和胎盤發(fā)育中起重要作用［7－10］。由于胎盤是最早印記的組織之一［11］。Wif1基因是在研究人胎盤腫瘤抑制基因時，被發(fā)現(xiàn)在人妊娠前3月胎盤滋養(yǎng)層細胞中表現(xiàn)為父源表達的印記基因［4］。關(guān)于Wif1基因在其他的物種和組織中的印記狀態(tài)尚未報道?；赟NP位點的RT－PCR產(chǎn)物直接測序法是一種分析印記基因的有效方法，前期研究中應(yīng)用此方法確定了Gtl2和Meg8在牛中的印記狀態(tài)［12－13］。本研究發(fā)現(xiàn)Wif1基因在牛中的印記具有組織特異性，在被分析的7個組織中，Wif1基因只在牛的肺中是印記的，表現(xiàn)為單等位基因表達；而在心、肝、脾、腎、肌肉、脂肪中表現(xiàn)為雙等位基因表達。表明Wif1基因的基因組印記具有物種特異性和組織特異性。

圖5 3頭雜合子牛（7、25和32號）肺和肝啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)和甲基化水平Fig.5 Methylation level and status of promoter region in lung and liver tissues of 3heterozygous cattle（7，25，32）

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾方式，通過改變轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而調(diào)控基因的組織特異表達、基因組印記和動物的正常發(fā)育［14－15］。Wif1基因啟動子區(qū)域的甲基化調(diào)控Wif1基因的表達，大量的研究證明Wif1基因的啟動子高甲基化與消化系統(tǒng)惡性腫瘤、鼻咽癌、膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤有密切關(guān)系［16－22］。5－氮－2′－脫氧胞苷（5－aza－dC）是一種甲基化抑制劑，在 DNA 復(fù)制過程中，5－aza－dC與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶形成一種共價復(fù)合物，抑制甲基轉(zhuǎn)移酶的甲基轉(zhuǎn)移活性，從而實現(xiàn)去甲基化功能。在膀胱癌等細胞系中加入5－aza－dC，可使Wif1 基因的 表 達恢復(fù)正常［23－26］。本研究中，為了探究甲基化在Wif1基因的組織特異性印記中可能發(fā)揮的作用，分析了啟動子區(qū)29個CpG位點的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)肺中9個CpG位點的甲基化水平發(fā)生改變。對其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域存在多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄表達水平的高低。如CREB是一種與細胞周期調(diào)控及記憶形成有關(guān)的核轉(zhuǎn)錄增強因子［27－28］。Sp1是廣泛和系統(tǒng)的生長調(diào)控因子之一，它參與了細胞生長和分化，對腫瘤的促進作用與其參與眾多癌基因、抑癌基因、細胞周期調(diào)控分子、生長相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的調(diào)節(jié)密切相關(guān)［29］。轉(zhuǎn)錄因子 AP－2家族是一類DNA 結(jié)合蛋白，以二聚體形式結(jié)合到DNA豐富GC的元件上，在基因表達調(diào)控、細胞分化、胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生中起著極為重要的作用。由于單個CpG的甲基化可能會影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，所以差異甲基化的CpG位點可能參與了Wif1基因的組織特異性印記。

圖6 肺和肝中每個CpG位點的甲基化率Fig.6 Methylation rate of each CpG site in lung and liver tissues

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