牛春麗，曾 菁，夏盟愷，彭 芳

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病中的一種，迄今為止UC 的病因、機制仍未明確，可能與遺傳、免疫、感染、精神心理等因素有關(guān)，UC 的治療主要在于炎癥的控制，目前臨床常用的藥物多依賴氨基水楊酸類、腎上腺皮質(zhì)激素等對機體不良反應(yīng)多的藥物，現(xiàn)有藥物的不良反應(yīng)表現(xiàn)為易出現(xiàn)肝腎毒性，極易產(chǎn)生耐藥性及潛在致畸等。隨著中藥研究的進(jìn)一步發(fā)展，中藥治療UC 發(fā)揮著越來越重要的作用，康復(fù)新液作為美洲大蠊干燥蟲體的乙醇提取物在以往的研究中對UC的作用已得到了肯定〔1-3〕，本研究立足美洲大蠊的另外制品，旨在進(jìn)一步開發(fā)出更多對UC高效低毒的藥物。本實驗研究的肝龍膠囊是采用現(xiàn)代提取分離技術(shù)所獲得的美洲大蠊另一有效成分，為了探討此有效成分在消化系統(tǒng)方面是否有效果，所以本實驗觀察了其對動物性結(jié)腸炎的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物BALB/C小鼠購自重慶騰鑫科技有限公司，雌雄各半，體重18～22 g，合格證號：SCXK（渝）2012-0003。

1.2 受試藥品及試劑肝龍膠囊（賽諾制藥公司，批號：國藥準(zhǔn)字Z20050113）；康復(fù)新液（賽諾制藥公司，批號：國藥準(zhǔn)字Z53020054）；美洲大蠊脫脂膏（由大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院劉光明教授提供，批號：20110906）。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS，MP Biomedicals生產(chǎn)，合格號：0216011080）；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20131018）；α-腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）免疫組化試劑盒（中杉金橋生物公司，批號：20110801）；生理鹽水（normal saline，NS）（昆明南疆制藥有限公司生產(chǎn)，批號：200803156）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及實驗方法 將90只小鼠隨機分為正常對照組，模型組，陽性對照組（康復(fù)新液0.36 mg/kg），肝龍膠囊高劑量組（100 mg/kg）、中劑量組（50 mg/kg）、低劑量組（25 mg/kg）；美洲大蠊脫脂膏高劑量組（200 mg/kg）、中劑量組（100mg/kg）、低劑量組（50mg/kg）。除正常組之外，其它組都給予3%DSS溶液自由飲用10 d〔4-6〕。飲用3%DSS第1天起，陽性對照組、肝龍膠囊組和美洲大蠊脫脂膏組按0.2 mL/10 g灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)10 d。模型組和正常對照組按0.2 mL/10 g灌胃NS，1 次／d，連續(xù)10 d。以上各組動物均置于代謝籠內(nèi)飼養(yǎng)每天觀察并記錄小鼠體重、大便性狀、皮毛及精神狀態(tài)等，并計算疾病活動指數(shù)（disease activity index ，DAI）〔7〕。實驗第10 天給藥后3 h處死小鼠，取結(jié)腸遠(yuǎn)端距肛門4 cm 至回盲部腸段，觀察并記錄所得結(jié)腸長度，沿腸系膜緣縱行剖開，稱取乙狀結(jié)腸段粘膜50 mg，將小鼠結(jié)腸組織在冰浴下制成5%勻漿（或-80 ℃保存，備用），按MPO試劑盒說明測定其含量。留取剩余結(jié)腸標(biāo)本（2 mm×10 mm），20%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色。結(jié)腸組織TNF-α的檢測采用免疫組化法檢測〔8-10〕。DAI評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 免疫組化圖像分析法 平均光密度是醫(yī)學(xué)圖像分析中的一個重要指標(biāo)，在離散圖像中每一個小區(qū)域由一個樣本點表示，每一個樣本點被稱為一個像素，每一個像素的明亮程度即代表這個區(qū)域的平均灰度，被稱為像素的平均灰度。在醫(yī)學(xué)圖像定量分析中常用平均光密度來表示，平均光密度與平均灰度之間可用公式計算〔11-12〕。免疫組化切片中陽性區(qū)的表達(dá)的強弱與光密度值呈正相關(guān)，與灰度值呈負(fù)相關(guān)。使用Image J圖像分析軟件，打開所需分析的免疫組化圖片，在Analyze 菜單中選取Set Measurements，從中選擇平均灰度，對選擇的陽性染色區(qū)域進(jìn)行測定，結(jié)果直接登錄到Excel表中，進(jìn)行計算得出平均光密度值后統(tǒng)計分析。計算公式為：

OD:平均光密度；Io:入射光強度，空白視野的平均灰度值；Ii:透射光強度，被測物體的平均灰度值。

2 結(jié)果

2.1 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎結(jié)腸長度的影響由表2 可見，對小鼠結(jié)腸長度的影響：所有飲用3%DSS的各組小鼠結(jié)腸長度都出現(xiàn)了不同程度的縮短，與NS組比較，模型組縮短最多（P＜0.01），美洲大蠊脫脂膏3 個劑量組，肝龍膠囊低劑量組顯著性縮短（P＜0.01），肝龍膠囊中劑量組縮短較少（P＜0.05），肝龍膠囊高劑量組，康復(fù)新液組與NS組比較縮短差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，NS 組，康復(fù)新液組，肝龍膠囊高、中劑量組顯著性增長（P＜0.01），美洲大蠊脫脂膏低劑量組增長較少（P＜0.05）；與康復(fù)新液組比較，模型組，美洲大蠊脫脂膏高劑量及中劑量組顯著性縮短（P＜0.01），肝龍膠囊低劑量組縮短較少（P＜0.05），肝龍膠囊高、中劑量組，美洲大蠊脫脂膏低劑量組與康復(fù)新液組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎結(jié)腸長度的影響（±s，n=10）

表2 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎結(jié)腸長度的影響（±s，n=10）

注:與NS 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與陽性組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別NS模型組肝龍膠囊高劑量組肝龍膠囊中劑量組肝龍膠囊低劑量組美洲大蠊脫脂膏高劑量組美洲大蠊脫脂膏中劑量組美洲大蠊脫脂膏低劑量組康復(fù)新液劑量/（mg/kg）100.00 50.00 25.00 200.00 100.00 50.00 0.36結(jié)腸長度/cm 6.22±0.66(正常)4.36±0.40**△△5.59±0.42##5.48±0.88*##4.99±0.70**△4.41±0.49**△△4.65±0.75**△△5.09±0.39**#5.69±0.98##

2.2 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎DAI 的影響由表3 可見，肝龍膠囊對小鼠DAI的影響：與NS組比較，飲用3%DSS各組都有不同程度的增大，其中模型組增大最多（P＜0.01），肝龍膠囊3 個劑量組、美洲大蠊脫脂膏3 個劑量組顯著性增大（P＜0.01），康復(fù)新液組與NS 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；與模型組比較，各組DAI 顯著性增大（P＜0.01）；與康復(fù)新液組比較，模型組，肝龍膠囊中、低劑量組及美洲大蠊脫脂膏中、低劑量組顯著性增大（P＜0.01），肝龍膠囊高劑量組增大較少（P＜0.05），美洲大蠊脫脂膏高劑量組與康復(fù)新液組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。DAI 描述的是體重下降、稀便、大便隱血3 種結(jié)腸炎炎癥活動的活躍情況，所以DAI 值的大小與結(jié)腸炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

表3 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎DAI的影響（±s，n=10）

表3 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎DAI的影響（±s，n=10）

注: 與 NS 組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與陽性組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別NS模型組肝龍膠囊高劑量組肝龍膠囊中劑量組肝龍膠囊低劑量組美洲大蠊脫脂膏高劑量組美洲大蠊脫脂膏中劑量組美洲大蠊脫脂膏低劑量組康復(fù)新液劑量/（mg/Kg）100.00 50.00 25.00 200.00 100.00 50.00 0.36 DAI 0.57±0.19 3.47±0.40**△△1.47±0.60**##△2.20±0.52**##△△2.24±0.67**##△△1.37±0.50**##2.10±0.43**##△△2.27±0.54**##△△0.93±0.68##

2.3 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎MPO含量的影響由表4可見，對小鼠MPO含量的影響：與NS 組比較，模型組增加顯著（P＜0.01），美洲大蠊脫脂膏、肝龍膠囊各劑量組、康復(fù)新液組MPO 含量與NS 比較差異都沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，肝龍膠囊高劑量組MPO 含量顯著性減少（P＜0.01），肝龍膠囊中、低劑量組，美洲大蠊脫脂膏中劑量組及康復(fù)新液組MPO 含量減少（P＜0.05），美洲大蠊脫脂膏高、低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與康復(fù)新液組比較，只有模型組MPO 含量增加（P＜0.05）。美洲大蠊脫脂膏各劑量組未出現(xiàn)明顯的藥物濃度依賴性。

表4 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎MPO含量的影響（±s，n=10）

表4 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎MPO含量的影響（±s，n=10）

注:與NS 組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與陽性組比較，△P＜0.05。

組別NS模型組肝龍膠囊高劑量組肝龍膠囊中劑量組肝龍膠囊低劑量組美洲大蠊脫脂膏高劑量組美洲大蠊脫脂膏中劑量組美洲大蠊脫脂膏低劑量組康復(fù)新液劑量/（mg/kg）100.00 50.00 25.00 200.00 100.00 50.00 0.36 MPO 含量/（U/g）0.26±0.12 0.86±0.38**△0.38±0.19##0.45±0.25#0.51±0.16#0.52±0.15 0.44±0.24#0.55±0.21 0.52±0.17#

2.4 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎組織病理學(xué)的影響由圖1可見：飲用3%DSS各組小鼠病理學(xué)檢查都出現(xiàn)了不同程度的炎性細(xì)胞浸潤以及腺體消失等現(xiàn)象，其中模型組炎性細(xì)胞浸潤明顯、也出現(xiàn)了大量的腺體、空杯細(xì)胞消失，而各藥物組的UC 現(xiàn)象都得到了一定的改善，其中肝龍膠囊高劑量組、美洲大蠊脫脂膏低劑量組和康復(fù)新液組都保持了較為完整結(jié)腸結(jié)構(gòu)。

圖1 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎組織病理學(xué)的影響

2.5 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎TNF-α免疫組化的影響將各組解剖所得結(jié)腸段用20%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，用TNF-α免疫組化試劑盒對切片進(jìn)行脫蠟、顯色，以觀察各組TNF-α表達(dá)量。

TNF-α陽性表達(dá)一般發(fā)生在細(xì)胞漿，顏色因表達(dá)強度由弱至強呈淺黃至深褐色。由圖2 可見：整個視野細(xì)胞漿呈深褐色，表現(xiàn)出較強的陽性表達(dá)，NS 組整個視野細(xì)胞漿呈藍(lán)色，未見陽性表達(dá)，而其它各組陽性面積較模型組比較都大大縮小，且顏色深度亦較淺。美洲大蠊、肝龍膠囊各劑量組和康復(fù)新液組都表現(xiàn)出了不同的陽性率。運用Image J 軟件法對每組切片的陽性表達(dá)區(qū)域進(jìn)行測定得出其平均灰度值，并進(jìn)行計算得到平均光密度值，平均光密度值與TNF-α表達(dá)強度呈正相關(guān)。見表5。

圖2 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎TNF-α的影響

由表5 可見，對小鼠TNF-α免疫組化平均光密度的影響：與NS 組比較，模型組增加最多（P＜0.01），肝龍膠囊高、中劑量組和美洲大蠊脫脂膏低劑量組顯著性增加（P＜0.01），康復(fù)新液組，美洲大蠊高、中劑量組及肝龍膠囊低劑量組與NS 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，各組平均光密度都顯著性減?。≒＜0.01）；與康復(fù)新液組比較，只有模型組顯著性增加（P＜0.01）。

表5 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎TNF-α免疫組化平均光密度的影響（±s，n=10）

表5 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎TNF-α免疫組化平均光密度的影響（±s，n=10）

注:與NS 組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與陽性組比較，△△P＜0.01。

組別NS模型組肝龍膠囊高劑量組肝龍膠囊中劑量組肝龍膠囊低劑量組美洲大蠊脫脂膏高劑量組美洲大蠊脫脂膏中劑量組美洲大蠊脫脂膏低劑量組康復(fù)新液劑量（mg/Kg）100 50 25 200 100 50 0.36平均光密度0.018±0.002 0.107±0.043**△△0.044±0.013**##0.048±0.008**##0.034±0.009##0.037±0.009##0.036±0.005##0.045±0.017**##0.034±0.012##

3 討論

本研究結(jié)果提示，肝龍膠囊、美洲大蠊脫脂膏對于DSS 所致小鼠急性UC 有一定的粘膜保護(hù)作用。與模型組比較，肝龍膠囊組、美洲大蠊脫脂膏組結(jié)腸長度增長，表明肝龍膠囊、美洲大蠊脫脂膏能減輕結(jié)腸粘膜破損、固有結(jié)構(gòu)喪失以及瘢痕生成等UC 炎癥反應(yīng)，保護(hù)小鼠結(jié)腸粘膜；與模型組比較，肝龍膠囊組、美洲大蠊脫脂膏組DAI 顯著性減?。≒＜0.01），表明肝龍膠囊、美洲大蠊脫脂膏能減輕UC 癥狀的嚴(yán)重程度。MPO 含量檢測中，美洲大蠊脫脂膏、肝龍膠囊各劑量組與康復(fù)新液組比較不存在統(tǒng)計學(xué)意義，且出現(xiàn)了表達(dá)量低于康復(fù)新液組的趨勢。在TNF-α免疫組化檢查中，美洲大蠊脫脂膏、肝龍膠囊各劑量組與康復(fù)新液組平均光密度比較亦不存在統(tǒng)計學(xué)意義，這說明美洲大蠊脫脂膏、肝龍膠囊各劑量組TNF-α表達(dá)強度與康復(fù)新液組相當(dāng)，表明美洲大蠊脫脂膏、肝龍膠囊各劑量組對急性UC 可能產(chǎn)生了與康復(fù)新液組相當(dāng)?shù)母纳谱饔谩Ｓ蓪嶒灲Y(jié)果推測，肝龍膠囊、美洲大蠊脫脂膏對DSS所致小鼠急性UC的保護(hù)作用可能與抑制中性粒細(xì)胞MPO 的釋放和降低結(jié)腸組織中TNF-α表達(dá)量有關(guān)。

UC 的病理改變主要表現(xiàn)為固有膜內(nèi)彌漫性炎性細(xì)胞浸潤，而急性UC主要為中性粒細(xì)胞浸潤，另外可見腺體、杯狀細(xì)胞減少等現(xiàn)象。通過本實驗的病理切片觀察，模型組小鼠的病理組織切片出現(xiàn)彌漫性的炎性細(xì)胞浸潤，且固有的結(jié)構(gòu)破壞；陽性藥及其它各給藥組粘膜炎性細(xì)胞與模型組比較浸潤程度不同程度地減少，排列緊密，且結(jié)構(gòu)基本保持完整。肝龍膠囊、美洲大蠊脫脂膏對DSS所致急性UC 有一定的保護(hù)作用，其作用可能與抑制中性粒細(xì)胞MPO 的釋放和降低結(jié)腸組織中TNF-α含量有關(guān)。本次實驗結(jié)果為以美洲大蠊為原料的藥品治療急性UC提供了一定的理論依據(jù)。

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