李 翔，陳新亮，龍 淼，＊

（1.沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順113112；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110866）

草酸（oxalic acid）又名乙二酸，分子式C2H2O22H2O，分子質(zhì)量為126.1u，是一種無色透明的結(jié)晶體。草酸有較強(qiáng)的酸性，并具有強(qiáng)烈的腐蝕性。在pH 大于5時(shí)能夠完全溶解，并且表現(xiàn)出很強(qiáng)的鈣配體性質(zhì)。草酸根離子也可以與其他陽離子結(jié)合，如鈉離子、鉀離子和氨根離子，因此它在自然界中多數(shù)以草酸鹽的形式存在［1］。草酸通過細(xì)菌、真菌和植物細(xì)胞的草酸乙酸鹽代謝、乙醛鹽代謝和L－抗壞血酸代謝等途徑合成代謝副產(chǎn)物草酸鹽［2］。而有機(jī)體通過各種催化劑來調(diào)控體內(nèi)草酸的含量不超過一定的正常范圍。草酸在哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程，往往其中的一些過程出現(xiàn)異常就會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如高草酸尿癥和草酸鈣結(jié)石。了解草酸在體內(nèi)的代謝過程，可深入理解草酸代謝紊亂引起的疾病，以及對(duì)這些疾病的防控研究提供思路。

1 草酸的來源

哺乳動(dòng)物的草酸攝取主要通過飲食來獲得，植物中的草酸是草酸的最主要來源。作為一種最簡單的二元羧酸，普遍存在漫長的生物進(jìn)化過程并無淘汰的趨勢，相反，大多數(shù)植物中的草酸含量可達(dá)到組織干重的6%～10%。草酸分為可溶性草酸與不溶性草酸兩種，兩種形式的草酸均由植物產(chǎn)生。不溶性草酸生成一些植物的針晶狀物質(zhì)來防止草食動(dòng)物攝入。可溶性草酸可以作為一種食源性毒素易被腸壁吸收，在腎臟沉積為草酸鈣結(jié)晶。另外，至少13種食物中的前體物如乙酸醛、抗壞血酸、羥脯氨酸、甘氨酸通過復(fù)雜的代謝途徑產(chǎn)生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的同時(shí)產(chǎn)生副產(chǎn)品草酸。對(duì)草酸鹽在植物界分布情況的調(diào)查表明，在93個(gè)屬中，除11個(gè)屬不含草酸鹽外，其余各屬絕大多數(shù)的種都含有大量草酸鹽。蓼科中的蕎麥，藜科中的鹽生草、藜、菠菜、甜菜，馬齒莧科的馬齒莧，莧科中的莧，醡漿草科中的醡漿草等含大量草酸，豆科中花生、苜蓿、大豆，胡椒科中的萎葉，禾本科中的水稻、高粱、美國狼尾草等含有較少草酸。葫蘆蘚科、罌粟科、杜仲科、白花丹科、葫蘆科、水鱉科、燈心草科、莎草科、次鱗草科等不含草酸。草酸鹽可存在與整個(gè)植株中，但不同部位含量不同，葉＞花＞果實(shí)＞種子＞根莖［3］。

2 草酸在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的代謝路徑

草酸直接通過飲食進(jìn)入身體，最終由肝臟進(jìn)行代謝。草酸可以由大量的日常食用的植物性食物如大黃、茶葉、巧克力、醡漿草、仙人掌、濱藜、酸生草和狼尾草等提供［4］。飲食中攝入的草酸超過50%通過尿液排出，內(nèi)源性生產(chǎn)可能是尿草酸形成的最大因素［5］。尿中草酸的升高是腎結(jié)石的危險(xiǎn)指標(biāo)。腎結(jié)石患者的草酸代謝量為2mmol／d，而通過尿液和糞便排泄的總的草酸量為1.78mmol／d［6］。草酸的總排泄量包括內(nèi)源性和飲食中的草酸在微生物降解后累積。草酸的轉(zhuǎn)運(yùn)大部分是通過與胃壁分泌的鹽酸作用下變?yōu)殛庪x子并與跨細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。特別是一些主要分布在小腸和大腸，已確定來自于SLC26基因家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［7］具有轉(zhuǎn)運(yùn)草酸作用。草酸鹽也可以在胃里被動(dòng)吸收，誘導(dǎo)大鼠的高草酸尿癥時(shí)發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸中存在的某種細(xì)菌可以誘導(dǎo)攝入的草酸進(jìn)入結(jié)腸，然后進(jìn)一步被結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌降解。大量的草酸鹽不能直接通過機(jī)體中的糞便和尿液排出體外，只會(huì)在腎小管和骨盆沉積使腎臟形成草酸鈣晶體從而導(dǎo)致腎臟結(jié)石，因此必須由微生物降解后才可以排泄。

2.1 草酸的微生物降解

哺乳動(dòng)物能代謝草酸主要是由腸道中存在降解草酸的微生物。第一類典型的草酸降解微生物是產(chǎn)甲酸草酸桿菌（Oxalobacter formigenes）。它是一種定居在飼草類動(dòng)物和部分哺乳動(dòng)物腸道的微生物，以草酸作為唯一碳源，大約40%的人類腸道中能分離出此菌［7］。此外，其他18個(gè)菌株已被確定有降解草酸的作用，包括在乳桿菌屬、腸球菌屬和雙岐菌屬的細(xì)菌等［8］。一種糞腸球菌在營養(yǎng)環(huán)境不良時(shí)，可以利用草酸作為唯一的碳源和能源，但在其他底物時(shí)可以生長的更好。

草酸在胃腸道內(nèi)的降解目前認(rèn)為需要兩步酶反應(yīng)。兩步酶反應(yīng)很好的描述了胃腸道內(nèi)草酸的微生物代謝反應(yīng)。O 型甲酸草酸桿菌的膜相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白草酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OXLT）可以對(duì)草酸進(jìn)行介導(dǎo)，同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)草酸到細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，草酸分別由草酰輔酶A 脫羧酶（OXC）和甲酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶（FRC）進(jìn)行微生物降解，2種酶分別由oxc和frc基因產(chǎn)生。oxc和frc基因已確定由一部分的降解草酸的腸道細(xì)菌產(chǎn)生，包括來自乳桿菌屬、腸球菌屬和雙歧菌屬的細(xì)菌等［9］。雖然這些菌屬?zèng)]有OXLT蛋白，但其他的蛋白可以介導(dǎo)草酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)入細(xì)菌的細(xì)胞膜內(nèi)。草酸降解時(shí)，一分子草酸可以形成一分子二氧化碳和一分子甲酸。雖然許多草酸降解細(xì)菌在胃腸道中具有共同的草酸降解通路，但不同類群的草酸降解目的不同。草酸桿菌，產(chǎn)甲酸草酸桿菌需要草酸作為碳源和能源生長，糞球菌也可以使用草酸作為碳源和能源。然而，乳酸桿菌屬，鏈球菌屬和雙岐菌屬在高濃度的草酸下生長被抑制，但它們也能夠降低草酸的濃度［9］。

2.2 腸道生態(tài)系統(tǒng)對(duì)草酸降解的影響

腸道生態(tài)系統(tǒng)影響草酸的降解作用。腸道細(xì)菌優(yōu)勢菌群不同，可影響草酸的降解，一些草酸降解微生物，如O型甲酸草酸桿菌和嗜酸乳桿菌可以大大降低草酸含量，而其他菌株，如干酪乳桿菌在同樣的條件下僅能降解五分之一的草酸。同時(shí)，草酸降解微生物數(shù)目增加，降解草酸的能力也相應(yīng)的增加。如白喉林（白喉林鼠）是一種草食動(dòng)物，飲食中含有豐富的草酸。乳酸桿菌占白喉林前腸菌群的13%，因?yàn)榘缀砹煮w內(nèi)的乳酸桿菌菌株具有顯著降解草酸的作用，并具有oxc基因，該類菌屬可能是哺乳動(dòng)物體內(nèi)降解草酸的優(yōu)勢菌屬。

腸道內(nèi)的pH 也是影響腸道內(nèi)草酸降解的一個(gè)重要因素。當(dāng)pH 從4.5增加到5.5時(shí)嗜酸桿菌降解草酸的oxc和frc的基因表達(dá)也相應(yīng)增加，但是pH 6.8時(shí)則表達(dá)減少［10］。同樣，在動(dòng)物雙歧桿菌屬試驗(yàn)中，適中的pH 變化時(shí)也存在類似的降低oxc基因表達(dá)的情況［11］。但是，O 型甲酸草酸桿菌在pH6.4時(shí)可以優(yōu)化草酸的降解。這種差異可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)腸道內(nèi)形成一個(gè)獨(dú)特的降解草酸的最佳pH 的位置。相應(yīng)的白喉林的草酸降解菌就可以在腸道最佳pH的位置分離到。草酸在最合適的位置降解效率大大增加，白喉林可以達(dá)到降解90%的飲食中攝入的草酸。除了直接影響草酸降解外，pH 與草酸之間的相互作用還可能對(duì)腸道內(nèi)的微生物降解草酸的菌群產(chǎn)生其他影響。嗜酸乳桿菌，暴露于pH6.8的含量為10mL／L的草酸中有315個(gè)基因下調(diào)，16個(gè)基因上調(diào)［10］。在這種條件下降解草酸的基因oxc和frc被抑制，可見，pH 對(duì)草酸降解非常重要。但研究報(bào)道，O型甲酸草酸桿菌能夠產(chǎn)生環(huán)狀脂肪酸，使其具有很強(qiáng)的耐酸性［11］，這也是O型甲酸草酸桿菌在不同pH 條件下，仍為草酸降解菌的原因之一。

不同的消化方式對(duì)草酸的微生物降解也產(chǎn)生重要影響。微生物降解草酸時(shí)，草酸為反應(yīng)物，草酰輔酶A 脫羧酶和甲酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶是該反應(yīng)的關(guān)鍵酶。在間歇性消化的動(dòng)物如兔的盲腸中，食糜離散分批的進(jìn)入，隨著時(shí)間的增加連續(xù)攪拌使食糜減少。這種消化方式使草酸與降解菌的酶最大程度的接觸從而減少了反應(yīng)時(shí)間。在連續(xù)攪拌槽消化方式，如反芻動(dòng)物瘤胃中，食糜是連續(xù)的與反應(yīng)物完全混合，保持恒定的濃度與反應(yīng)速率［12］。在這種類型的腸胃中，食糜完全的均勻的通過以確保與反應(yīng)物（微生物酶）均勻的接觸。在活塞式流動(dòng)消化方式如馬或人的結(jié)腸中，食糜不斷的少量的間斷的與反應(yīng)物混合。這種消化方式中反應(yīng)物是隨著進(jìn)入食道的長度減少的。當(dāng)食物在胃腸道內(nèi)維持恒定濃度的均勻混合時(shí)，這種消化方式對(duì)胃腸道內(nèi)的微生物菌群影響最大。

2.3 草酸與胃腸道內(nèi)的微生物的生態(tài)相互作用

草酸對(duì)胃腸道內(nèi)的微生物的生態(tài)相互作用很復(fù)雜，研究者確定了與草酸代謝相關(guān)的4個(gè)細(xì)菌組群，該4個(gè)細(xì)菌組群很好的闡述草酸與其相互作用。第1組包含的細(xì)菌類群，可以使用草酸作為生長的資源。這類細(xì)菌會(huì)迅速對(duì)腸道環(huán)境中的草酸相對(duì)或絕對(duì)增加做出反映。當(dāng)向羊瘤胃中直接加入0.6mmol草酸時(shí)，O 型甲酸草酸桿菌在草酸的環(huán)境下，7d 內(nèi)從0.2%增加到0.7%，對(duì)應(yīng)于四倍的總DNA 的增加量［13］。第2組包含的細(xì)菌類群，被草酸抑制，但如果它們存在時(shí)會(huì)降低草酸的量。這種特殊的組群可能比第一組群更為常見，常見的菌屬包括雙歧桿菌、鏈球菌和乳酸桿菌。例如，嗜酸乳桿菌在10mmol／L的草酸環(huán)境中，3d內(nèi)降解11.8%的草酸，同時(shí)自身增加5倍的菌群數(shù)，而在20mmol／L的草酸中，草酸也降解了3.4%，而菌群數(shù)只增加2倍［14］。第2組細(xì)菌可能通過降解草酸從而間接的利用降解草酸的資源，當(dāng)在競爭中處于不利地位時(shí)，它可以利用草酸作為碳源和能量。草酸的降解可以給它們一個(gè)相對(duì)于那些不能抑制草酸并降解草酸的細(xì)菌一個(gè)競爭優(yōu)勢。在第3組中，細(xì)菌的生長受草酸的抑制，但它們可以間接的受益于其他細(xì)菌對(duì)草酸的降解。由于草酸降解菌的存在會(huì)讓第3組細(xì)菌在一個(gè)不適的環(huán)境中成長，在高濃度草酸環(huán)境中它們依賴于第1組和第2組菌群。第4組包含那些不受草酸存在影響的細(xì)菌?？傊@4組細(xì)菌完全的表達(dá)了細(xì)菌在有草酸存在的環(huán)境時(shí)的生長效率。

在整個(gè)細(xì)菌菌群中，個(gè)別菌群的數(shù)量變化可以用來跟蹤草酸的降解情況，這需要對(duì)飲食進(jìn)行試驗(yàn)控制，同時(shí)利用同位素跟蹤的方法。例如，老鼠接受O型甲酸草酸桿菌后恒定的表現(xiàn)出草酸水平明顯降低。在大鼠缺乏草酸降解菌時(shí)并提供15g／kg的草酸飲食，6d內(nèi)在尿中草酸的排泄量增加［15］。隨著時(shí)間的推移，草酸排泄量的增加指示著飲食中草酸的攝入量的增加或微生物對(duì)草酸的適應(yīng)不良。另外哺乳動(dòng)物腸道中的草酸降解微生物也相應(yīng)的隨著草酸的飲食量與時(shí)間的增加而增加，草酸的降解率也增加。而在另外不攝入草酸的動(dòng)物中，草酸的降解率保持不變。增加的草酸降解率可能是由于草酸降解菌快速反應(yīng)的結(jié)果，如O型甲酸草酸桿菌等微生物增加的結(jié)果。

3 草酸降解的益生菌

某些抗生素的反復(fù)使用會(huì)導(dǎo)致天然的草酸降解細(xì)菌的損失。哺乳動(dòng)物的腸道內(nèi)的草酸降解細(xì)菌可以進(jìn)行人為的篩選來實(shí)現(xiàn)更有效的草酸降解和疾病預(yù)防。Hatch M 等［16］試驗(yàn)表明，大鼠2周內(nèi)每天給予O型甲酸草酸桿菌減少39%～80%尿草酸排泄。同樣的，Hoppe B等［17］試驗(yàn)結(jié)果表明，人類給予O 型甲酸草酸桿菌4周表現(xiàn)出22%～92%的尿草酸排泄的減少。草酸降解的活性和O 型甲酸草酸桿菌的定植通常得持續(xù)的連續(xù)接種，或者維持豐富的草酸飲食。在大鼠和人類中，細(xì)菌的活性和定植能力會(huì)在低草酸飲食后5d內(nèi)迅速失去［16］。任志華［18］從犬糞便中分離出47株犬源草酸耐受乳酸菌，包括22株乳桿菌、6株乳球菌、4株腸膜明串珠菌和15株腸球菌。24／47（51.63%）株乳酸菌具有降解草酸的能力，飼喂試驗(yàn)證明，8株分離菌能顯著降低犬尿液草酸濃度。為預(yù)防犬尿結(jié)石提供了新的思路。Lieske J C等［19］研究表明，使用混合益生菌稱為“oxadrop”（VSL制藥），其中含有嗜酸乳桿菌，短乳桿菌，嗜熱鏈球菌，和嬰兒雙歧桿菌。雖然服用oxadrop采取正常飲食，同時(shí)可以減少草酸排泄量，但當(dāng)用低草酸鹽飲食時(shí)，oxadrop失去效果。Palgi N 等［20］用草酸降解菌的微生態(tài)制劑治療高草酸尿癥時(shí)，表現(xiàn)出額外的微生物與微生物之間代謝性的相互作用可能間接支持草酸降解。相比之下，接種益生菌的個(gè)體，即使在在低草酸飲食之后，自然種群的草酸降解菌仍存留于腸道。因此，接種益生菌有助于草酸的降解［21］。

4 草酸降解基因工程菌

脊椎動(dòng)物體內(nèi)并不存在天然的草酸降解酶，因此，需要通過外源獲得補(bǔ)充人體需要的草酸降解酶［22］。如何讓脊椎動(dòng)物獲得外源酶，最好的辦法是構(gòu)建基因工程菌。賴德軍等［23］將甲酸草酸桿菌草酸代謝基因Frc轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21后穩(wěn)定表達(dá)代謝草酸相關(guān)性酶－甲酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶（FCAT）對(duì)草酸具有降解效能。Chen Z 等［24］將食草酸桿菌中草酸降解基因frc及oxc克隆，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至小鼠腸干細(xì)胞，使腸表皮細(xì)胞獲得草酸降解能力。Figueiredo M C［25］將F.velutipes 和B.subtilis 中 的oxc基因克隆，成功構(gòu)建真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至貓腎細(xì)胞，后者獲得顯著的草酸降解能力。這些研究為預(yù)防和治療高草酸尿癥和草酸鈣結(jié)石提供了新的思路。

5 展望

草酸降解益生菌的開發(fā)以及篩選對(duì)其他一些營養(yǎng)代謝類疾病的治療以及防控打開一個(gè)新的方向。但由于微生物的移植成功的機(jī)制尚未闡明。微生物移植到其他動(dòng)物比先前原有的這些微生物的動(dòng)物體內(nèi)復(fù)雜得多。因此，整個(gè)菌群的移植的療效，必須在所得的移植微生物群的組成和所轉(zhuǎn)移的微生物的持久性等幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估。而草酸降解基因工程菌的構(gòu)建雖然為預(yù)防和治療高草酸尿癥和草酸鈣結(jié)石提供了新的思路，但其表達(dá)量及酶的活性還需要進(jìn)一步提高。

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