楊光大，肖嘉杰，龔世平，王付民＊，魏玉峰

（1.廣東省野生動物救護中心，廣東廣州510520；2.廣東省昆蟲研究所，廣東廣州510260；3.廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣東廣州510260）

曼氏裂頭蚴（Plerocercoid）為曼氏迭宮絳蟲（Spirometramansoni）的幼蟲階段，是原尾蚴隨受感染蝌蚪發(fā)育而成，具較強的感染性和致病性，可侵入人體引起危害嚴重的曼氏裂頭蚴?。⊿parganosis mansoni）。該病廣泛流行于東亞和東南亞地區(qū)，在歐洲、美洲和非洲也有報道［1］。在我國已有數(shù)千例報告，其中廣東省報道的病例最多，占全國的10%左右［2］。近年來，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、金標免疫滲濾技術（dot immunogold filtration assay，DIGFA）和免疫印跡（Western blot）技術已逐漸應用于人體曼氏裂頭蚴病的診斷，并建立了明確的衛(wèi)生學診斷標準［3］。然而，在蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷方面，類似快速診斷技術近乎空白，更無商品化檢測試劑盒的推出。蛇蛙是曼氏迭宮絳蟲重要的第二中間宿主和轉續(xù)宿主，在人曼氏裂頭蚴病感染上有著重要作用［2］；此外，蛇蛙曼氏裂頭蚴病可嚴重影響蛇蛙的生長和繁殖，對食用蛇蛙養(yǎng)殖產業(yè)的標準化、規(guī)?；蜔o公害發(fā)展具有重要影響。因此，論文針對近年來曼氏裂頭蚴病診斷方法的研究現(xiàn)狀進行綜述，期望對蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷技術的研究提供參考。

1 曼氏裂頭蚴病的診斷

1.1 病原學診斷

病原學檢查是曼氏裂頭蚴診斷的金標準［4］。在人體臨床診斷中，通常采用活體組織檢查方法來獲得蟲體，進而通過形態(tài)學觀察來判定是否為裂頭蚴感染［5］。迄今為止，已明確的曼氏裂頭蚴蟲體基本形態(tài)學特征為：呈長帶形，乳白色或淡黃色，長0.5 cm～30cm，寬0.3cm～1cm；蟲體不分節(jié)，但有不規(guī)則橫皺褶，體前端無吸槽；蟲體的頂端中央有一孔向內凹陷成隧道狀，向后延伸一定距離后形成盲管［3］。曼氏裂頭蚴病組織病理切片的組織學和免疫組化鑒定是病原學診斷另一重要手段，對蟲體不完整或形態(tài)學鑒定較為困難的蟲體標本具有重要的應用價值［4］。組織病理切片觀察曼氏裂頭蚴具有四大鑒定特征：體壁皺褶、密集的體毛、體腔內的石灰小體和較細的肌束，這些特征會因為取樣切取部位不同而略有差異［4，6］。另外，曼氏裂頭蚴可以在人體內不斷遷移，在某些部位造成組織炎癥與肉芽腫反應，蟲體感染周圍組織的病理學特征也常作為病原學檢查的依據(jù)［6］。在人體中，寄生于深部組織或中樞神經系統(tǒng)等部位的蟲體不易發(fā)現(xiàn)病灶，漏檢率高，誤診性大，故病原學診斷方法的局限性也較大［4］。

1.2 影像學診斷

近年來電子計算機斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）等技術越來越多應用于曼氏裂頭蚴病的鑒別診斷，特別是人體中樞神經系統(tǒng)裂頭蚴病［3，7］。目前，已成熟或明確的影像學方法有兩種：（1）CT檢查［3］。CT檢查腦曼氏裂頭蚴病具有以下影像學特征：①白質區(qū)不規(guī)則的低密度占位灶，反映白質退行性病變；②點狀鈣化灶；③病灶結節(jié)狀或不規(guī)則增強，可能出現(xiàn)感染肉芽腫。（2）MRI檢查［7］。MRI也多應用于腦裂頭蚴病的臨床診斷，其影像學特征為：①CT上白質區(qū)不規(guī)則、不均勻的低密度占位灶，MRI上表現(xiàn)為T1W低信號，T2W高信號，鄰近腦室可有擴大，即所謂負效應；②點狀鈣化影；③病灶點狀增強或迂曲的線條狀增強或串珠狀增強影；④反復檢查發(fā)現(xiàn)病灶遷徙性。但CT和MRI檢查多用于寄生于深部組織或中樞神經系統(tǒng)等部位的蟲體的輔助診斷，且需要多次檢查進行比較和鑒別診斷，比較費時費力，也有一定局限性［7］。

1.3 血清免疫學診斷

血清免疫學診斷方法具有創(chuàng)傷小、敏感性高、特異性強和簡便經濟的優(yōu)點，已廣泛應用于人體曼氏裂頭蚴病診斷中，對輕度感染、早期感染、隱性感染和深部組織寄生的病例，是一種良好的檢查手段，可彌補病原學和影像學診斷的不足［3，8-9］。目前，國內市場上已有多種基于人體血清中特異性抗體IgY或IgM的試劑盒［10］。近年來，國內外已建立數(shù)十種血清免疫學診斷方法，其中3種已列入衛(wèi)生學診斷標準［3］：①酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。該方法以曼氏裂頭蚴排泄-分泌抗原（excretory-secretory，ES）作為診斷抗原，通過間接ELISA方法檢測病人血清中蟲體特異性IgG抗體，具有高度的敏感性和特異性，穩(wěn)定性和重復性良好，易于大范圍推廣。但該方法尚不能完全消除與其他寄生蟲病的交叉性反應［3，8］；②斑點免疫金滲濾法（DIGFA）。該方法將曼氏裂頭蚴可溶性抗原點樣于硝酸纖維素膜上，以膠體金-SPA為檢測標記物，采用垂直流滲濾裝置檢測病人血清中特異性IgG抗體。該方法操作簡單，不需特殊設備，但所用抗原為蟲體粗抗原，與其他寄生蟲病存在明顯的交叉反應，僅適用于疑似病例的初篩或輔助檢查［3］；③免疫印跡。該方法以曼氏裂頭蚴ES抗原作為診斷抗原，進行常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并制備抗原膜，再進行免疫學檢測，當分子質量36ku和29ku抗原帶出現(xiàn)陽性反應時判定為陽性結果［3，9］。

1.4 分子生物學診斷

近年來，分子生物學技術快速發(fā)展為曼氏裂頭蚴病診斷提供了新途徑。目前，曼氏裂頭蚴cDNA文庫已成功構建［10-11］，通過大規(guī)模測序篩選和生物信息學分析，從中已挑選具有潛在診斷價值的Sm18、W1和 W2等抗原基因［10-11］；其中，進行Sm18基因已進行克隆表達，已制備出可用于免疫診斷的重組抗原（Sm18），為研制曼氏裂頭蚴免疫診斷試劑盒提供良好基礎［10］。蘭智華［12］用曼氏裂頭蚴線粒體細胞色素C氧化酶1（cox1）特異性基因引物作重復PCR擴增，對鑒定裂頭蚴蟲體感染重要意義。Bennett H M 等［13］在一例腦裂頭蚴病診斷中，以cox1基因為標記并進行序列分析，確診了腦曼氏裂頭蚴感染。整體上而言，分子生物學診斷方法目前尚不成熟，其敏感性、特異性和可靠性需要進一步提高或驗證，客觀上也極大限制了該方法在臨床檢測中的應用［10-11，13］。

2 蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷技術

2.1 病原學和分子生物學診斷

迄今為止，病原學檢查是蛇蛙曼氏裂頭蚴病流行病學調查中最常用的方法。據(jù)不完全統(tǒng)計，該方法在烏梢蛇（Zoacysdhumnades）、滑鼠蛇（Ptyas mucosus）、灰鼠蛇（Ptyaskorros）和眼鏡蛇（Naja najaatra）等23種蛇類和虎紋蛙（Ranarugulosus）、黑斑蛙（Rananigromaculata）、金線蛙（Rana plancyi）和澤陸蛙（Fejervaryamultistriata）等15種蛙類檢測中運用［1，14-24］。近些年，PCR技術也迅速應用于蛇蛙曼氏裂頭蚴DNA診斷鑒定方面［20-24］。Liu W 等［20］對黑斑蛙裂頭蚴cox1基因進行擴增測序分析，系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，所有黑斑蛙均為曼氏裂頭蚴感染。黎建華［21］通過對黑斑蛙裂頭蚴線粒體DNApnad5和prrnS基因的多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)pnad5和prrnS兩段基因可以作為蛙曼氏裂頭蚴有效的遺傳標記，并為種內遺傳多態(tài)性研究提供基礎。曾利娟等［22］以湖南4個地區(qū)黑斑蛙中采集的曼氏裂頭蚴作為研究對象，PCR擴增其nad1基因的部分序列（pnad1）并進行序列分析，結果顯示曼氏裂頭蚴nad1序列為570bp，為曼氏裂頭蚴進一步的分類、鑒定和遺傳變異研究奠定了基礎。李雯雯等［23］以從草腹鏈蛇（Amphiesmastolatum）分離到的1株裂頭蚴為研究對象，分別利用核糖體小亞基（18SrDNA）、大亞基（28SrDNA）、內轉錄間隔區(qū)（ITS）和cox1對分離的裂頭蚴進行分類鑒定，結果顯示該蟲株為曼氏裂頭蚴，并通過分子種系發(fā)育關系推斷cox1比ITS更適合用于種內遺傳多態(tài)性研究，ITS則適合做定種的分子標記。吳有陵［24］對王錦蛇（Elaphecarinata）、赤鏈蛇（Dinodonrufozonatum）和黑眉錦蛇（Elaphetaeniura）分離到裂頭蚴為對象，以cox1基因為分類基因，種系發(fā)育樹分析顯示所分離的裂頭蚴都是曼氏裂頭蚴。

2.2 蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷中存在的問題

目前，蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷主要依靠蟲體基本形態(tài)學特征來鑒定，分子生物學檢測技術也有一定的進展。然而，在蛇蛙曼氏裂頭蚴病鑒定方面仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。

2.2.1 病原學診斷 病原學檢查是曼氏裂頭蚴病鑒定的金標準［4］，也是蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷中最常用方法。然而，在當今的蛇蛙曼氏裂頭蚴病防控工作中，該檢查方法存在以下四個方面缺點：①該方法通常依賴蛇蛙整體剖檢過程來完成，需要耗費大量的人力物力，且需要專業(yè)的現(xiàn)場及技術人員，在大規(guī)模流行病學調查中，不易實施。②野生蛇蛙受法律保護，部分蛇蛙為國家或省重點的保護動物，通過處死大量蛇蛙來開展曼氏裂頭蚴病的監(jiān)測工作，有悖于我國野生動物資源保護的工作目的及理念。③我國南方地區(qū)存在食用或藥用蛇蛙的傳統(tǒng)習俗，每年都會消費大量的蛇蛙，通過專業(yè)人員的病原學檢查來保障和實現(xiàn)蛇蛙的無害化工作是不現(xiàn)實。④病原學鑒定的主要方式是形態(tài)學觀測，但這些方法也是不嚴謹?shù)?，并不能對蟲株進行精確的定種和種內遺傳多樣性分析［23］，需要血清免疫學和分子生物學等其他技術的綜合應用。

2.2.2 免疫學診斷 目前，免疫學診斷在蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷方面并無應用。雖然在人體曼氏裂頭蚴病診斷方面，免疫學方法是成熟的檢測技術，且應用廣泛，但兩爬類動物免疫特征與哺乳類有較大差異，如兩爬類動物只存在4種免疫球蛋白類型IgM、IgX（對應于哺乳動物IgA）、IgY（被認為是IgG和IgE的進化前體）和IgF［25］，這給完全照搬人體免疫學診斷技術帶來了一定挑戰(zhàn)和很大不確定性。蛇蛙曼氏裂頭蚴病免疫學診斷技術的建立，要克服或解決以下四個方面問題：①蛇蛙曼氏裂頭蚴感染后的特異性抗體IgY或IgM抗體水平和動態(tài)變化，為ELISA、DIGFA和 Western blot法在蛇蛙曼氏裂頭蚴早期感染和診斷方面的應用提供基礎；②蛇蛙IgY或IgM提取和純化技術，為DIGFA法在蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷中的應用提供質控IgY或IgM；③尋找可被裂頭蚴感染蛇蛙血清（特異性抗體IgY或IgM）識別的蟲體排泄分泌（ES）抗原，為Western blot法在蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷中的應用提供技術支撐；④積累蛇蛙其他常見寄生蟲感染的陽性血清，為ELISA法在蛇蛙曼氏裂頭蚴診斷上的交叉反應的驗證或排除提供實驗材料保障。

2.2.3 影像學診斷 影像學診斷技術在珍稀瀕危野生蛇蛙檢測方面具有一定前景，對珍稀瀕危野生蛇蛙資源保護具有重要應用價值。但該診斷方法需要專業(yè)儀器設備，耗費較大，且沒有兩棲及爬行動物專用的儀器設備，人體影像學儀器設備能否直接應用，尚需大量驗證和科學研究。

2.2.4 分子生物學診斷 分子生物學技術快速發(fā)展為蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷提供了新途徑，但目前仍存在一些問題：①曼氏裂頭蚴基因組數(shù)據(jù)庫還不夠完善，目的基因篩選也很有限，極大限制了可用于免疫診斷的高度特異性重組抗原的制備；②目前已建立的分子生物學檢查方法，主要用于曼氏裂頭蚴蟲株的定種和種內遺傳多樣性分析，多從專業(yè)科研角度出發(fā)來進行探討和研究，不利于大規(guī)?；鶎油茝V和應用；③PCR是分子生物學診斷核心技術，其操作復雜，對設備、技術人員及實驗條件要求高，單個成本費用也高，如不能基于該技術推出商品化試劑盒，將是該方法推廣應用的瓶頸因素。

3 展望

我國南方地區(qū)食用或藥用蛇、蛙的傳統(tǒng)歷史悠久［14-16］，要在短期內改變民眾傳統(tǒng)的消費習俗是困難的和不現(xiàn)實的，因此我國曼氏裂頭蚴病防控工作任重而道遠。展望未來，為促進我國蛇蛙養(yǎng)殖的產業(yè)化、規(guī)?；蜔o害化發(fā)展，保障人類公共衛(wèi)生安全，需要重點開展4個方面工作：①建立蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷的林業(yè)行業(yè)標準。野生動物疫病監(jiān)測防控是林業(yè)行政主管部門的法定職責，廣東省已將蛇蛙曼氏裂頭蚴病列入《廣東省需要重點監(jiān)測的野生動物疫病名錄》。未來要爭取盡快立項和制訂“蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷”林業(yè)行業(yè)標準，為蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷標準化和規(guī)范化提供技術支撐；②加大從業(yè)人員蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷技術培訓。我國野生動物疫病監(jiān)測防控工作尚處于起步階段，有關管理人員、業(yè)務骨干和養(yǎng)殖人員對蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷檢測技能薄弱，難以保障和實現(xiàn)我國蛇蛙養(yǎng)殖產業(yè)健康發(fā)展和食品安全工作，因此，相關從業(yè)人員的技能培訓工作對從食物源頭防控曼氏裂頭蚴病具有重要意義；③開發(fā)和上市蛇蛙專用曼氏裂頭蚴病診斷試劑盒。試劑盒具有簡潔、經濟、快速和準確等優(yōu)點，開發(fā)和上市蛇蛙專用曼氏裂頭蚴病診斷試劑盒，有利于曼氏裂頭蚴病診斷技術大規(guī)模推廣和應用；④重點篩選高度特異性的曼氏裂頭蚴目的基因。在成功篩選高度特異性的曼氏裂頭蚴目的基因基礎上，制備高度特異性重組蛋白，進而開發(fā)蛇蛙專用的曼氏裂頭蚴病生物工程疫苗或診斷試劑，對曼氏裂頭蚴病的源頭防控也具有重要意義。

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