劉建群，劉 健

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

基于蕨素聚類分析的鳳尾蕨屬藥用植物化學(xué)分類研究

劉建群，劉 健

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

目的：研究鳳尾蕨屬5 種藥用植物蕨素類活性成分，為其質(zhì)量評價、鑒定及親緣關(guān)系研究提供依據(jù)，為鳳尾蕨屬植物化學(xué)分類深入研究奠定基礎(chǔ)。方法：采用HPLC-DAD 測定5 種藥用植物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位的蕨素類成分。比較蕨素種類和含量差異，并以蕨素類特征成分及其含量為分類性狀，采用聚類分析對鳳尾蕨屬藥用植物進(jìn)行化學(xué)分類研究。結(jié)果：從大葉井口邊草、半邊旗、全緣鳳尾蕨、蜈蚣草和鳳尾草中分別檢測出蕨素類成分59、39、3、7和22個，總體來看大葉井口邊中蕨素類成分含量最高，而全緣鳳尾蕨中蕨素類成分含量最低。運(yùn)用系統(tǒng)聚類將5 種藥用植物聚成3類: 第Ⅰ類為全緣鳳尾蕨、蜈蚣草和鳳尾草; 第Ⅱ類為半邊旗；第Ⅲ類為大葉井口邊草。結(jié)論：半邊旗與全緣鳳尾蕨、蜈蚣草和鳳尾草之間的化學(xué)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。蕨素聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果有較好的一致性。蕨素類成分HPLC-DAD圖譜可用于鳳尾蕨屬植物的鑒別和分類研究，并可為其質(zhì)量評價提供重要參考。

鳳尾蕨屬；蕨素；高效液相色譜法；聚類分析；化學(xué)分類

鳳尾蕨屬(Pteris)隸屬于鳳尾蕨科(Pteridaceae)，全世界約有300種，產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，南達(dá)新西蘭、澳大利亞(塔斯馬尼亞)及南非洲，北至日本及北美洲。我國現(xiàn)知有66種，主要分布于華南及西南，少數(shù)種類向北到達(dá)東及秦嶺南坡[1]。根據(jù)秦仁昌等對鳳尾蕨科系統(tǒng)分類[2]，中國植物志按照植物的形態(tài)特征將鳳尾蕨屬分為網(wǎng)眼鳳尾蕨組(Sect.Campteria)、鳳尾蕨組(Sect.Pteris)和篦形鳳尾蕨組(Sect.Quadriauricula)3組。目前鳳尾蕨屬有近30種植物有化學(xué)成分研究報道，特別是關(guān)于鳳尾草(Pterismultifida)、半邊旗(Pterissemipinnata)和蜈蚣草(Pterisvittata)等研究報道較多。該屬植物中主要含有蕨素類倍半萜、對映貝殼杉烷型二萜以及黃酮類化學(xué)成分[3-9]。目前，鳳尾蕨屬部分植物主要作為民間藥用，用于抗腫瘤、抗菌消炎和保肝抗氧等臨床應(yīng)用[3]。例如：半邊旗中的對映貝殼杉烷型二萜具有很好的體外抗腫瘤作用[8]；蜈蚣草多糖、鳳尾草多糖對大腸桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和青霉菌等均有不同程度的抑菌活性[10]；鳳尾草和蜈蚣草中的黃酮類成分具有較好的保肝抗氧化作用[11-12]。目前已從鳳尾蕨屬植物中分離了許多蕨素類成分[4-6]，研究表明蕨素類化合物具有顯著的生理活性，如保肝、抗氧化、抗癌、促進(jìn)人類腸吸收功能、止痙攣、治療糖尿病及肥胖等作用[13-17]。蕨素為蕨類植物特有的特征成分，為1-茚酮結(jié)構(gòu)(見圖1)。該類成分具有很好的藥用價值、植物鑒別和化學(xué)分類學(xué)意義[18-19]。鳳尾蕨屬相同組系有的植物從形態(tài)上區(qū)分比較困難，例如鳳尾草與大葉井口邊草(PteriscreticaL. var.nervosa)等。目前關(guān)于鳳尾蕨屬蕨素類成分及化學(xué)分類的系統(tǒng)研究很少。本文采用HPLC-DAD 測定了鳳尾蕨屬5種藥用植物(全緣鳳尾蕨、蜈蚣草、鳳尾草、半邊旗和大葉井口邊草)的蕨素類成分，共檢出該類成分80多個，并首次以蕨素類特征成分及其含量為分類性狀，采用聚類分析對鳳尾蕨屬5種藥用植物進(jìn)行化學(xué)分類研究，評價了種間親緣關(guān)系，以期為鳳尾蕨屬植物化學(xué)分類研究提供新思路。

圖1 蕨素結(jié)構(gòu)圖

1 材料與儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(四元泵、柱溫箱、DAD檢測器和Agilent 1260 色譜工作站)；Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)；乙腈(HPLC級，ACS公司)；甲醇和甲酸(分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；雙蒸水(自制)。半邊旗、全緣鳳尾蕨、蜈蚣草和鳳尾草藥材全草于2013年10月采自江西省萍鄉(xiāng)市，大葉井口邊草全草采自江西省南昌市，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室劉建群教授分別鑒定為鳳尾蕨科植物半邊旗(Pterissemipinnata)、全緣鳳尾蕨(Pterisinsignis)、蜈蚣草(Pterisvittata)、鳳尾草(Pterismultifida)和大葉井口邊草(PteriscreticaL. var.nervosa)，憑證標(biāo)本(NO．2013101P、NO．2013102P、NO．2013103P、NO．2013104P和NO．2013105N) 保存于江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液配制

精密稱取5種藥材粉末各1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加甲醇20 mL，加熱回流60 min，過濾，減壓蒸干，用10 mL水混懸，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，減壓蒸干溶劑后用5 mL甲醇溶解，溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，得四個部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位)樣品溶液。

2.2 色譜條件

石油醚部位：Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0～80 min, 15 ∶85～100 ∶0；80～90 min, 100 ∶0)，流速1.0 mL/min，檢測波長258 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

乙酸乙酯部位：Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0～5 min, 5 ∶95；10～35 min, 15 ∶85；55～95 min,17 ∶83～100 ∶0)，流速1.0 mL/min，檢測波長258 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

正丁醇部位：Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0～5 min, 5 ∶95；24～34 min, 11 ∶89；55～70 min, 20 ∶80～60 ∶40；80～90 min，100 ∶0)，流速1.0 mL/min，檢測波長258 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

水部位：Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0～5 min, 5 ∶95；20～25 min, 11 ∶89；30～35 min,15 ∶85；50～60 min，25 ∶75～100 ∶0；70 min，100 ∶0)，流速1.0 mL/min，檢測波長258 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.3 五種鳳尾蕨屬藥材石油醚部位HPLC和蕨素類成分聚類分析

筆者前期研究報道了蕨素類成分的紫外光譜特征如下[20]：蕨素紫外光譜具有3個特征紫外吸收峰, 最大吸收波長和摩爾吸光系數(shù)范圍為: λmax1(290～330 nm )， ε1(103 L/ mol·cm) ; λmax2(245～270 nm)， ε2(103～104L/ mol·cm) ; λmax3(200～230 nm)， ε3(104～105L/ mol·cm )，3 個紫外吸收峰摩爾吸光系數(shù)比約為: ε1∶ε2∶ε3≈1∶(3～9)∶(4～20)。五種鳳尾蕨屬藥材石油醚部位HPLC色譜圖見圖2A，蕨素類成分(大葉井口邊草石油醚部位保留時間27.952 min)的典型DAD紫外光譜見圖3。根據(jù)蕨素紫外光譜特征以及DAD紫外光譜圖鑒定出HPLC色譜圖中的蕨素，并將保留時間和峰面積歸納于表1。以蕨素類特征成分及其含量為分類性狀，采用SPPS軟件對鳳尾蕨屬5種藥用植物石油醚部位進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4A。從圖4A可以看出，5 種藥用植物聚成3類: 第Ⅰ類為全緣鳳尾蕨、蜈蚣草和鳳尾草; 第Ⅱ類為半邊旗；第Ⅲ類為大葉井口邊草。半邊旗與全緣鳳尾蕨、蜈蚣草和鳳尾草之間的化學(xué)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)中國植物志[1]，全緣鳳尾蕨、蜈蚣草、鳳尾草和大葉井口邊草同屬于鳳尾蕨組，而半邊旗屬于篦形鳳尾蕨組。聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果有較好的一致性。聚類分析結(jié)果表明鳳尾蕨組的大葉井口邊草與同組其它3種距離較遠(yuǎn)，可能因為產(chǎn)地差異原因或本身因素導(dǎo)致，值得進(jìn)一步研究。鳳尾草與大葉井口邊草同屬鳳尾蕨組，從植物形態(tài)上區(qū)分十分困難。結(jié)果表明，本方法可明顯區(qū)分這兩種植物。研究表明，蕨素類成分HPLC圖譜可用于鳳尾蕨屬植物的分類和鑒別研究，并可為鳳尾蕨屬藥用植物質(zhì)量控制提供重要參考。

圖2 五種鳳尾蕨屬藥材各部位HPLC色譜圖

圖3 蕨素類成分的典型DAD紫外光譜圖表1 五種鳳尾蕨屬藥材石油醚部位蕨素類 成分保留時間和峰面積

保留時間/min大葉井口邊草半邊旗全緣鳳尾蕨蜈蚣草鳳尾草4.641000012.88.7655500009.07233.2000012.97836.8000016.47818.3000017.94523.8000018.08818000024.5580502.5015.9027.9527011.73008.416.6109.4798.829.959032.100033.542478.3135008034.127110.2000038.76850.8000049.678234.500063.850.3555.466.700052.0551992.8409.1041.726088.36222.70000

圖4 五種鳳尾蕨屬藥材四個部位蕨素類成分系統(tǒng)聚類分析圖

2.4 五種鳳尾蕨屬藥材乙酸乙酯部位HPLC和蕨素類成分聚類分析

5種鳳尾蕨屬藥材乙酸乙酯部位HPLC色譜圖見圖2B。按2.3項下方法，根據(jù)蕨素紫外光譜特征以及DAD紫外光譜圖鑒定出HPLC色譜圖中的蕨素，并將保留時間和峰面積歸納于表2。以同2.3項下方法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4B。從圖4B可以看出，5 種藥用植物乙酸乙酯部位蕨素聚類結(jié)果與石油醚部位基本一致。

表2 五種鳳尾蕨屬藥材乙酸乙酯部位蕨素類

2.5 五種鳳尾蕨屬藥材正丁醇部位HPLC色譜圖和蕨素類成分聚類分析

5種鳳尾蕨屬藥材乙酸乙酯部位HPLC色譜圖見圖2C。按2.3項下方法，根據(jù)蕨素紫外光譜特征以及DAD紫外光譜圖鑒定出HPLC色譜圖中的蕨素，并將保留時間和峰面積歸納于表3。以同2.3項下方法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4C。從圖4C可以看出，5 種藥用植物正丁醇部位蕨素聚類結(jié)果與石油醚部位基本一致。

表3 五種鳳尾蕨屬藥材正丁醇部位蕨素類

2.6 五種鳳尾蕨屬藥材水部位HPLC色譜圖和蕨素類成分聚類分析

5種鳳尾蕨屬藥材乙酸乙酯部位HPLC色譜圖見圖2D。按2.3項下方法，根據(jù)蕨素紫外光譜特征以及DAD紫外光譜圖鑒定出HPLC色譜圖中的蕨素，并將保留時間和峰面積歸納于表4。以同2.3項下方法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4D。從圖4D可以看出，5 種藥用植物水部位蕨素聚類結(jié)果與石油醚部位基本一致。

表4 五種鳳尾蕨屬藥材水部位蕨素類

從鳳尾蕨屬5種藥材大葉井口邊草、半邊旗、全緣鳳尾蕨、蜈蚣草和鳳尾草中分別檢測出蕨素類成分59、39、3、7和22個，總色譜峰面積分別為32 984.1、16 120、49.8、341.2和3 875.1?？傮w來看大葉井口邊草中蕨素類成分含量最高，而全緣鳳尾蕨中蕨素類成分含量最低。

3 討 論

鳳尾蕨屬5種藥用植物石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位、水部位蕨素和總蕨素類成分聚類分析結(jié)果基本一致。結(jié)果顯示：5 種藥用植物聚成3類: 第Ⅰ類為全緣鳳尾蕨、蜈蚣草和鳳尾草; 第Ⅱ類為半邊旗；第Ⅲ類為大葉井口邊草。半邊旗與全緣鳳尾蕨、蜈蚣草和鳳尾草之間的化學(xué)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)中國植物志，全緣鳳尾蕨、蜈蚣草、鳳尾草和大葉井口邊草同屬于鳳尾蕨組，而半邊旗屬于篦形鳳尾蕨組。聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果有較好的一致性。聚類分析結(jié)果表明鳳尾蕨組的大葉井口邊草與同組其它3種距離較遠(yuǎn)， 可能因為產(chǎn)地差異原因或本身因

素導(dǎo)致，值得進(jìn)一步研究。鳳尾草與大葉井口邊草同屬鳳尾蕨組，從植物形態(tài)上區(qū)分十分困難。結(jié)果表明，本方法可明顯區(qū)分這兩種植物。總體來看大葉井口邊中蕨素類成分含量最高，而全緣鳳尾蕨中蕨素類成分含量最低。研究表明，蕨素類成分HPLC圖譜可用于鳳尾蕨屬植物的分類和鑒別研究，并可為鳳尾蕨屬藥用植物質(zhì)量控制提供重要參考。

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Study on the Chemotaxonomy of GenusPterisbyCluster Analysis of Pterosins

Liu Jianqun, Liu Jian

(Key Laboratory of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China)

Objective: To study on the chemotaxonomy ofPterisby cluster analysis of pterosins. Methods: The HPLC-DAD method was established for the determination of the pterosins in fivePterisspecies. A cluster analysis of the characteristic pterosins was used for the chemotaxonomy of thesePterisspecies. Results: 59, 39, 3, 7 and 22 pterosins were identified by HPLC-DAD fromPteriscreticaL. var.nervosa,Pterissemipinnata,Pterisinsignis,PterisvittataandPterismultifida, respectively. Pteris cretica L. var.nervosashowed the highest amount of pterosins andPterisinsignis showed the lowest content of pterosins in five species. A cluster analysis of these species ofPterisindicated that they were divided into three groups:Pterisinsignis,PterisvittataandPterismultifidawere classified into group Ⅰ,Pterissemipinnatain group Ⅱ,PteriscreticaL. var.nervosain group Ⅲ, respectively. Conclusion: The significant differences betweenPterisinsignis,Pterisvittata,PterismultifidawithPterissemipinnatawere observed．The obtained results were in agreement with the traditional taxonomic study．The result indicted that the above method can be used to authenticate, classify and quality controlPterisspecies．

Pterisgenus; pterosin; HPLC; cluster analysis; chemotaxonomy

2015-03-28

國家自然科學(xué)基金資助項目(30960495)。

劉建群(1970-)，男，教授，博士，主要從事中藥活性成分及質(zhì)量評價研究。E-mail：liu5308@sina.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.05.002

R284.1

A

1006-9690(2015)05-0004-05