劉 敬,王 清,辛貴忠,劉麗芳*,劉建群

(1.中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

UPLC-Triple TOF-MS方法鑒定野漆樹苷在大鼠體內(nèi)的代謝物

劉 敬1,王 清1,辛貴忠1,劉麗芳1*,劉建群2*

(1.中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

目的：分析野漆樹苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。方法：大鼠灌胃給予野漆樹苷96 mg/kg 后，收集0～24 h 尿液及糞便樣品，應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜 (UPLC-Triple TOF-MS) 技術(shù)分析野漆樹苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。結(jié)果：共檢測到了除原型藥的4個代謝產(chǎn)物。經(jīng)過對野漆樹苷可能代謝產(chǎn)物的母離子和碎片離子的準(zhǔn)確分子量及裂解規(guī)律的解析，并結(jié)合黃酮類化合物的可能代謝途徑，推斷出了這些代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。結(jié)論：上述實驗結(jié)果將為血漿代謝產(chǎn)物的尋找提供靶標(biāo)，為野漆樹苷體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)的確立以及體內(nèi)代謝途徑和代謝機制的研究提供重要的參考。

野漆樹苷；大鼠體內(nèi)；代謝物；UPLC-Triple TOF-MS

野漆樹苷 (Rhoifolin，芹菜素-7-O-新橙皮糖苷，簡稱RH) 是來源于泡桐花、化橘紅、山香及鳳尾草等中藥中的一種黃酮類活性成分[1]，具有抗氧化[2]、抗登革熱、有助于胰島素受體磷酸化等作用[3-5]。近年來，關(guān)于野漆樹苷的報道越來越多，2010年版中國藥典收錄的山香及其制劑山香圓片的含量測定項就是以野漆樹苷為指標(biāo)成分的[6]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠灌胃給予野漆樹苷后，在血漿中檢測到野漆樹苷原型藥的含量較低，推測其在體內(nèi)發(fā)生了廣泛的代謝，可能主要以代謝產(chǎn)物形式存在于血液與組織中，因此有必要研究野漆樹苷在動物體內(nèi)的代謝途徑。本實驗灌胃給予大鼠野漆樹苷后，采用 UPLC-TripleTOF-MS 法初步分析了野漆樹苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC-30A 液相色譜-AB Triple TOF 5600四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(數(shù)據(jù)采集AnalystTF1.6 AB Sciex，數(shù)據(jù)分析Peak View Software Version 2.0)；BS124S 萬分之一電子分析天平(Sartorius)；KH-250DB 超聲清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；TGL-16C臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；IKA VortexGenius 3 渦旋儀(萊貝科學(xué)儀器有限公司)；DW-40L262 低溫保存冰箱(青島海爾特種電器有限責(zé)任公司)。

1.2 藥品與試劑

野漆樹苷樣品(本實驗室自制，純度大于98%)；水：哇哈哈純凈水；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)；其它試劑均為分析純。

圖1 野漆樹苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.3 動物

雄性SD 大鼠6只，體重(250±10)g，購于南京青龍山實驗動物中心，許可證號SCXK (蘇)2012-0004；在(22±2)℃ 環(huán)境飼養(yǎng)，自由攝食，飲水。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：Thermo Hypersil GOLD 色譜柱 (100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；柱溫30 ℃；流動相：A 為甲醇，B 為水溶液，梯度洗脫程序：0～20 min，A (45%～90%)，20～25 min，A (90%～90%)，25～25.1 min，A (90%～45%)，25.1～30 min，A (45%)；流速：0.3 mL/min；進樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：AB Triple TOF 5600 四極桿飛行時間質(zhì)譜儀采用電噴霧離子化 (ESI) 源，噴霧電壓 (IS)：-4 500 V，離子化溫度 (TEM)：600 ℃；霧化氣 (GS1)：60 kPa，輔助加熱 (GS2)：60 kPa；氣簾氣 (CUR)：35 kPa；碰撞氣 (CAD)：Medium；掃描模式: Negative。一級質(zhì)譜采集范圍為m/z100～1 000，累積時間250 ms，二級質(zhì)譜采集范圍為m/z100～1000，累積時間100 ms，碰撞能量 (CE): -35 V；碰撞能量疊加 (CES):15。

1.5 樣品的采集和處理

將6只大鼠置于代謝籠中，禁食12 h，不禁水，收集空白尿液和糞便。然后每只大鼠灌胃野漆樹苷(劑量為96 mg/kg)，收集給藥后24 h內(nèi)的尿液和糞便。取尿液0.5 ml，加甲醇1 mL，渦旋30 s，12 000 r/min，冷凍離心10 min (4 ℃),取上清液進行LC-MS/MS分析。糞便自然晾干，研碎，取糞樣0.5 g，加50%甲醇10 mL超聲提取30 min，即得糞便勻漿。取一定量勻漿12 000 r/min冷凍離心2次，每次10 min (4 ℃), 取上清液進行LC-MS/MS分析。

2 結(jié) 果

2.1 野漆樹苷的色譜行為

由于生物樣品中存在的內(nèi)源性物質(zhì)較多，所以我們不僅分開代謝產(chǎn)物和內(nèi)源性物質(zhì)，而且還需要使各代謝產(chǎn)物之間盡可能的分離。通過對流動相條件的優(yōu)化，在本實驗確定的液相條件下，野漆樹苷和芹菜素的液相色譜保留時間分別為1.583 min和4.461 min，其色譜圖見圖2。

2.2 野漆樹苷的質(zhì)譜行為

在負(fù)離子檢測方式下，獲得野漆樹苷的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰 (m/z577) 和芹菜素的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰 (m/z269)，碰撞誘導(dǎo)解離 (CID) 分析該準(zhǔn)分子離子，獲得二級質(zhì)譜圖，見圖2,野漆樹苷的主要碎片離子為m/z269,為野漆樹苷脫去一分子新橙皮糖產(chǎn)生的碎片離子，也是芹菜素的特征離子峰。芹菜素的主要碎片離子為m/z225、151、117，其中m/z151和m/z117分別為芹菜素C環(huán)C1-C2和C3-C4鍵斷裂的碎片離子形成的。

圖2 野漆樹苷(A)和芹菜素(B)的總提取離子流色譜圖 和二級質(zhì)譜圖

2.3 大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析

對大鼠的尿樣和糞樣進行LC-MS/MS分析。相同檢測條件下，給藥后的尿樣和糞樣與給藥前空白尿樣和糞樣比較，發(fā)現(xiàn)與野漆樹苷相關(guān)的化合物的準(zhǔn)分子離子峰，分別為m/z269、703、703及271，各化合物保留時間分別為4.461、2.186、2.780及3.041 min，總離子流色譜圖見圖3,提取離子流色譜圖見圖4。野漆樹苷在大鼠體內(nèi)可能的代謝產(chǎn)物的色譜質(zhì)譜相關(guān)信息見表1，大鼠體內(nèi)可能的代謝途徑及代謝物的鑒定過程見圖5。

圖3 大鼠灌胃野漆樹苷后體內(nèi)代謝產(chǎn)物的色譜質(zhì)譜圖

圖4 大鼠灌胃野漆樹苷后體內(nèi)野漆樹苷及其代謝產(chǎn)物的提取離子流色譜圖

M0：在m/z577的提取離子流色譜圖中，尿樣和糞樣中均檢測到1個色譜峰，保留時間為1.583 min,其色譜峰與野漆樹苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間一致，EPI質(zhì)譜圖與野漆樹苷標(biāo)準(zhǔn)品有相同的碎片離子，所以判斷1.583 min色譜峰為野漆樹苷。野漆樹苷在大鼠尿樣和糞樣中均檢測到，可能為原型藥物野漆樹苷，也可能為原性藥物經(jīng)代謝后再結(jié)合新橙皮糖產(chǎn)生的Ⅱ相代謝產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與原型野漆樹苷相同。

M1：在m/z269的提取離子流色譜圖中，可以檢測到1個與原型藥相關(guān)的色譜峰，保留時間為4.464 min，命名為M1，主要碎片離子為m/z225、151和117。將M1與芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品進行比對分析，發(fā)現(xiàn)其色譜信息和質(zhì)譜信息均與芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品相同，鑒定M1為代謝產(chǎn)物芹菜素。

M2：在m/z703的提取離子流色譜圖中，可以檢測到2個與原型藥相關(guān)的色譜峰，保留時間分別為2.186 min和2.780 min，命名為M2-1和M2-2。

M2-1的保留時間為2.186 min，其在質(zhì)譜中為[M+HCOOH-H]-峰，主要碎片為m/z597、395、269、231、117。M2和M1相比多80和46 (HCOOH特征峰)，其中碎片離子m/z269與M0的碎片離子相同，由于二級質(zhì)譜中硫酸化結(jié)合物的主要質(zhì)譜裂解規(guī)律是產(chǎn)生脫去80的碎片離子，因此推測其可能為野漆樹苷 (M0) 的硫酸化結(jié)合物，結(jié)合位點可能為A環(huán)的C5位或B環(huán)的C4位羥基，其中m/z117為C環(huán)裂解后的B環(huán)部分，m/z231為C環(huán)裂解后的A環(huán)部分，所以確定其結(jié)合位點發(fā)生在A環(huán)C5位羥基。

M2-2與M2-1相比，其保留時間不同，為2.780 min，但準(zhǔn)分子離子峰及部分碎片離子m/z577、269相同，可推測其也可能為野漆樹苷 (M0) 的硫酸化結(jié)合物。其中m/z151為C環(huán)裂解后的A部分，m/z197為C環(huán)裂解后的B環(huán)部分，因此確定其結(jié)合位點發(fā)生在B環(huán)C4位羥基。

M3：在m/z271的提取離子流色譜圖中，可以檢測到1個與原型藥相關(guān)的色譜峰，保留時間為3.041 min，命名為M3，主要碎片離子為m/z177、151、119，與芹菜素 (M1) 的碎片離子相似，其中m/z151為B環(huán)裂解后的A環(huán)部分，m/z119比芹菜素的B環(huán)裂解后的C環(huán)部分多2，推測可能是芹菜素加上2H的代謝產(chǎn)物，推測加氫位點為C2-C3。

表1 大鼠灌胃野漆樹苷后體內(nèi)代謝產(chǎn)物的色譜質(zhì)譜信息

圖5 野漆樹苷在大鼠體內(nèi)的代謝途徑

3 討 論

藥物的大部分代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與原型藥物相近，并且含有原型藥物的特征質(zhì)譜裂解碎片或中性丟失，因此可通過特征碎片離子、特征中性丟失或者特征碎片離子間質(zhì)量差推斷代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)[7]。本研究通過 LC-MS/MS 初步分析鑒定了灌胃給藥后，野漆樹苷在大鼠糞便及尿液中代謝產(chǎn)物，其中2個Ⅰ相代謝產(chǎn)物 (M1和M3)，2個Ⅱ相代謝產(chǎn)物 (M2-1和M2-2)。對于代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的鑒定與確證，標(biāo)準(zhǔn)品對照法是一種比較準(zhǔn)確且成熟的方法，該方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，目前已有很多研究證明了該方法的合理性與可靠性[8-9]。綜合代謝產(chǎn)物的色譜信息與質(zhì)譜信息，發(fā)現(xiàn)芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品和代謝產(chǎn)物M1的色譜信息及質(zhì)譜信息完全相同，由此可見，代謝產(chǎn)物M1為芹菜素，同時也證明了該代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的合理性與正確性。

黃酮類化合物主要在體內(nèi)的腸道和肝臟代謝，其水解反應(yīng)較多發(fā)生在腸道[10]，有研究表明在腸粘膜乳糖酶根皮苷水解酶的作用下黃酮糖苷可水解成苷元[11]。本研究表明野漆樹苷在大鼠體內(nèi)主要生成脫新橙皮糖基的苷元芹菜素，而一部分芹菜素又在微粒體酶催化下，生成柚皮素。大鼠灌胃野漆樹苷經(jīng)腸粘膜吸收，可在硫酸轉(zhuǎn)移酶等Ⅱ相酶作用下，發(fā)生Ⅱ相結(jié)合反應(yīng)，生成硫酸結(jié)合物。

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Metabolites of Rhoifolin in Ratsinvivoby UPLC-Triple TOF-MS

Liu Jing1, Wang Qing1, Xin Guizhong1, Liu Lifang1*, Liu Jianqun2*

(1.The State Key Laboratory of Natural Medicines Components and Pharmcodynamics, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2.Key Laboratory of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Traditional Medicine, Nanchang 330004, China)

Objective: In vivo study of the metabolites of rhoifolin (RH) in rats. Methods: An UPLC-Triple TOF-MS method was established and applied to identify the metabolites of RH in urine and feces after ig administration of RH (96 mg/kg) to rats. Results: A total of four metabolites were identified in urine and feces of rats. The structures of these metabolites were calculated by a comprehensive analysis of precursor and fragment ions of possible metabolites. Conclusion: These results would provide support for seeking plasma metabolites, discovering bioactive constituents, and clarifying metabolic pathways of RH.

rhoifolin; the ratsinvivo; metabolites; UPLC-Triple TOF-MS

2014-12-28

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目及國家自然科學(xué)基金資助項目(30960495)。

劉敬(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：現(xiàn)代中藥分析。E-mail: liusijiatong@163.com

*通訊作者：劉麗芳，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥分析方法研究。E-mail: liulifang69@126.com 劉建群,男,博士,教授,研究方向為中藥活性成分及質(zhì)量評價。E-mail: liu5308@sina.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.05.006

R284.1

A

1006-9690(2015)05-0023-05