程 芹，呂康模，康 涵，鄧 佳，劉 平，蔣利萍

（1.重慶醫(yī)科大學，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學附屬成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川610031；3.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院免疫研究室，重慶400014）

Rett綜合征臨床分析及甲基化CpG結合蛋白-2基因調查

程 芹1，2，呂康模2，康 涵2，鄧 佳2，劉 平2，蔣利萍3

（1.重慶醫(yī)科大學，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學附屬成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川610031；3.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院免疫研究室，重慶400014）

目的探討甲基化CpG結合蛋白2（MECP2）基因突變在4例疑似Rett綜合征（RTT）患者中的致病作用及基因測序對協(xié)助診斷RTT的意義。方法選擇2014年4～8月重慶醫(yī)科大學附屬成都市婦女兒童中心醫(yī)院收治的4例疑似RTT患者，即病例1、2、3、4，病例1為家族先證者，病例2為病例1的母親，病例3、4為散發(fā)患者，家系依次為A、B、C。對4例患者進行臨床資料分析、家系調查、核型分析等，并對患者及其父母MECP2基因進行聚合酶鏈反應擴增測序。結果病例1、4通過2010年最新RTT的修訂診斷標準及基因診斷確診，病例2、3的臨床診斷不成立但發(fā)現(xiàn)致病基因突變，病例1、2為國內首例母女同患RTT，其MECP2基因測序為同一個國內未報道的突變位點，病例3、4家系中發(fā)現(xiàn)已有文獻報道的致病位點突變。結論RTT臨床診斷可能與基因診斷結果不一致，基因診斷對確診RTT，尤其是臨床癥狀不典型的病例具有重要價值；疑診患者早期完成基因診斷可降低醫(yī)療成本、早期開始康復訓練并輔助優(yōu)生優(yōu)育。

Rett綜合征； 基因； 序列分析； 遺傳咨詢； 甲基化CpG結合蛋白-2

Rett綜合征（Rett syndrome，RTT）是一種嚴重影響兒童智力運動發(fā)育的疾病，1966年由Rett[1]首先報道，該病主要發(fā)現(xiàn)于女童，為女性智力發(fā)育遲緩的較常見病因，男性中罕見，女性人群發(fā)病率為1/10 000~1/15000，其中絕大部分為新發(fā)病例，僅有0.5%~1.0%為家族遺傳。1999年Amir等[2]發(fā)現(xiàn)，RTT與定位于Xq28的甲基化CpG結合蛋白2（methyl CpG binding protein 2，MECP2）基因相關。本研究通過對就診患者進行臨床資料分析、家系調查、核型分析并對患者及父母的MECP2基因進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增測序，探討MECP2基因突變在RTT患者中的致病作用及基因測序對協(xié)助診斷RTT的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年4～8月重慶醫(yī)科大學附屬成都市婦女兒童中心醫(yī)院收治的疑似RTT患者4例，即病例1、2、3、4，年齡分別為3歲零4個月、33歲、1歲零9個月、4歲零10個月，均為四川地區(qū)人員；病例1、2為母女，病例3、4為散發(fā)患者。家系依次為A、B、C。本研究通過重慶醫(yī)科大學附屬成都市婦女兒童中心醫(yī)院倫理委員會審批，所有受檢者及家屬知情同意并簽字。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷 采用2010年最新RTT的修訂診斷標準進行臨床診斷。

1.2.2 家系調查 觀察4例患者及父母相關臨床表現(xiàn)，并搜集血樣標本進行檢測。

1.2.3 核型分析 采集患者及父母靜脈血3 mL，用肝素抗凝，培養(yǎng)制片，送重慶醫(yī)科大學附屬成都市婦女兒童中心醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心閱片。

1.2.4 基因測序 采集患者及父母靜脈血2 mL，用乙二胺四乙酸抗凝，采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京BioTeke）進行基因組DNA提取。根據(jù)美國國立生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫MECP2（NM_001110792）參考序列設計引物，MECP2-1：上游引物為5′-AGTAATTTGCAGCTTATCCTT-3′，下游引物為5′-TGGCACAGTTATGTCTTTAG-3′，擴增目的片段為438 bp；MECP2-2：上游引物為5′-GCCTCTGCTCACTTGTTCTG-3′，下游引物為5′-ACACCTGGTCTCAGTGTTCATT-3′，擴增目的片段為551 bp；MECP2-3：上游引物為5′-CACCATCCGCTCTGCCCTAT-3′，下游引物為5′-GCAATCCGCTCCGTGTAAAGT-3′，擴增目的片段為1 250 bp。使用Roche PCR Master試劑盒進行PCR，擴增體系為30 μL，反應液混勻瞬時離心后使用BIO-RADS1000型PCR儀進行擴增反應，擴增程序為94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證后送英濰捷基（上海）生物技術有限公司進行雙脫氧鏈終止法測序。測序結果與標準序列（NM_001110792）進行比對。

2 結 果

2.1 臨床特征 （1）病例1：女，3歲零4個月。因進行性語言倒退1年就診。入院前1年，患兒無誘因出現(xiàn)語言倒退，不愿說話，喜吃手，喜將5個手指全部放入口腔中，睡醒時有雙目凝視，四肢抖動，持續(xù)約數(shù)秒后緩解，緩解后無煩躁不安、意識模糊、疲勞感等。入院前1+年曾被重慶醫(yī)科大學附屬成都市婦女兒童中心醫(yī)院診斷為“孤獨癥”。多次檢查提示異常腦電圖。（2）病例2：女，33歲。因生育RTT女兒要求檢查就診。就診時喪失語言能力及目的性肢體活動能力，喜絞手，不能獨立行走。既往史：曾于2歲時發(fā)生嚴重跌倒創(chuàng)傷，診斷為“顱腦損傷”，后開始出現(xiàn)肢體活動異常。家族史：2個哥哥、1個姐姐表型無異常，患者生育RTT女兒，即病例1。（3）病例3：女，1歲零9個月。因智力發(fā)育遲緩1+年就診。喜將手放入口腔，未習得語言能力，目的性肢體活動功能退化，不能示物，步態(tài)不穩(wěn)。既往史：5個月時患“肺炎”，后開始出現(xiàn)四肢肌張力下降。生產(chǎn)史及家族史無特殊。（4）病例4：女，4歲零10個月。因運動語言進行性退化3+年就診。喜彈指，語言及目的性肢體活動功能退化，就診時可喚“爸爸、媽媽”。既往查腦電圖見癲癇波。生產(chǎn)史：孕1產(chǎn)1，因“過期產(chǎn)”行剖宮產(chǎn)娩出，家族史無特殊。病例1、4符合RTT診斷標準，病例1為非典型RTT，病例4為典型RTT，按疾病分期分別處于疾?、颉ⅱ笃?。病例2、3符合排除標準，故臨床診斷不成立，見表1、2。

表1 4例患者臨床特征及診斷標準

表2 典型RTT癥狀分析

2.2 家系遺傳分析 家系A系罕見母女遺傳致病基因發(fā)病，家系B、C為散發(fā)患者，無家族史。家系C因個人原因拒絕家族其他成員采血進行分析，家系A、B遺傳圖譜見圖1。

圖1 家系A、B遺傳圖譜

2.3 家系染色體分析 3個家族共4例患者、5例直系血親染色體分析均為正常核型，除外染色體疾病，見表3。

表3 4例患者家系核型、基因及表型調查結果

2.4 4例患者家系核型、基因、臨床癥狀調查 4例患者均發(fā)現(xiàn)MECP2基因突變，全部為雜合性突變，突變率為100%。病例1、2突變位點相同，二者第1157～1200位核苷酸出現(xiàn)44bp核苷酸缺失，表示為c.1157～1200del 44 bp；相應氨基酸轉錄發(fā)生截短。病例3第808位核苷酸C＞T無義突變；病例4第502位核苷酸C＞T無義突變，二者氨基酸轉錄終止。4例患者均為已報道突變，見圖2、3，表3。

圖2 病例1、2 MECP2基因檢測結果

圖3 病例3、4 MECP2基因檢測結果

3 討 論

RTT為女性智力發(fā)育遲緩的較常見病因，常見于女童，女性發(fā)病率為1/10 000～1/15 000。目前，RTT的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)，重慶醫(yī)科大學附屬成都市婦女兒童中心醫(yī)院收治的4例患者均符合診斷標準中的4條主要標準（符合率為100%），故納入檢測。但隨后病史采集中發(fā)現(xiàn)，病例2曾于2歲時受嚴重顱腦損傷，損傷后出現(xiàn)神經(jīng)運動發(fā)育異常，傷后以“顱腦損傷”隨訪，未給予特殊治療，本病例符合RTT排除標準的第1條。病例3小于6個月齡時有肺部感染病史，隨后發(fā)現(xiàn)肌張力下降、語言發(fā)育遲滯等異常表現(xiàn)，發(fā)病年齡與排除標準的第2條相符。二者RTT臨床診斷不成立。進一步染色體檢查除外二者染色體病變，病例3 MECP2基因檢測發(fā)現(xiàn)了已有文獻報道致病的突變位點，病例2發(fā)現(xiàn)了新發(fā)突變并生育了典型RTT患兒。據(jù)此，作者認為，對具有診斷RTT主要標準或符合排除標準者，應將基因診斷歸為重要輔助診斷標準，如本研究中病例1、2患者如無基因診斷的確診，均可能繼續(xù)按“孤獨癥、顱腦損傷”等疾病治療，延長了診治時間，增加了家庭經(jīng)濟負擔及醫(yī)療資源費用。

RTT系X連鎖顯性遺傳疾病，發(fā)病原因多與MECP2基因突變有關。MECP2基因定位于人類染色體Xq28，包含4個外顯子，已發(fā)現(xiàn)的突變達200余種，主要突變部位為3、4外顯子。MECP2是豐富的染色質結合蛋白，含有甲基化CpG結合區(qū)及轉錄抑制區(qū)，在神經(jīng)發(fā)育過程中通過轉錄水平調控影響基因功能。張曉英等[3]研究發(fā)現(xiàn)，RTT患兒MECP2突變率為87.5%（308/352），熱點突變主要包括p.T158M[15.6%（55/352）]、p.R270X、p.R255X、p.R306C、p.R294X、p.R133C、p.R106W、p.R3066C、p.R3066C、p.G269fsX288[4.3%（15/352）]及大片段缺失[6.0%（21/352）]。本研究發(fā)現(xiàn)，國內首例母女同患RTT，該病僅0.5%~1.0%為家族遺傳，本病例在國際上也屬罕見。對其家族調查發(fā)現(xiàn)，MECP2基因新發(fā)突變c.1157~ 1200 del 44 bp，國內尚無該突變的文獻報道，但在已發(fā)現(xiàn)突變中有鄰居位點突變 c.1152 del 44 bp、c.1158~ 1167/1171~1186 del、1164 del 44 bp等的文獻報道，國外僅1例該突變致RTT的文獻報道[4]，但非家族遺傳，作者認為，該位點突變應考慮為病例1、2致病的根源，其出現(xiàn)罕見家族遺傳現(xiàn)象可能與該新發(fā)突變位點表達相關。國內目前有MECP2基因突變母女遺傳的文獻報道[3]，但不同于本研究，已有文獻報道的家系中僅有患兒發(fā)病，母親表型正常。該類罕見RTT遺傳機制尚不確切，MECP2突變除對下游靶基因腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子起作用而致病外[5]，不同MECP2基因突變在表達通路上的差異尚需進一步研究。

病例4為本研究中唯一1例典型RTT患兒，且臨床與基因檢測結果相符，基因檢測為熱點突變之一，與大量文獻報道相符。

MECP2基因致病性突變在女性中主要表現(xiàn)為RTT，典型男性RTT患兒罕見，偶有文獻報道。目前，對有智力運動發(fā)育異常的男性患兒進行MECP2基因檢測，在 Angelman綜合征[6]、孤獨癥[7]、精神發(fā)育遲滯[8]等患兒中均發(fā)現(xiàn)致病性突變，提示MECP2基因突變在男性與女性之間可有不同表型，但具體原因仍待進一步研究。另有文獻報道，少數(shù)RTT致病性突變與細胞周期依賴激酶5[9]、FOXG1（Forkhead box G1）[10]基因相關。

已有的家族遺傳RTT的文獻報道中均為母系遺傳，因此，除致病性突變MECP2基因遺傳外，Naidu等[11]提出了應該對線粒體遺傳物質進行分析的假設，孟洪弟等[12]報道3例RTT患兒融合細胞線粒體見空泡改變，以琥珀酸為底物時氧耗降低34.0%，唐炬等[13]對15例RTT患兒及其中14例母親進行的研究發(fā)現(xiàn)，13例患兒及11例母親存在線粒體突變，線粒體DNA突變可考慮為有家族史的RTT的另一致病原因。

RTT目前尚無有效根治方法，早期康復治療是改善運動姿勢、減輕關節(jié)變形、肌肉萎縮的主要手段。對睡覺障礙者可給予曲唑酮、水合氯醛誘導睡覺，左卡尼汀（左旋肉毒堿）維持睡眠。維生素D對改善骨骼發(fā)育遲緩及減輕骨骼變形可能有效。有癲癇癥狀者給予左乙拉西坦等常規(guī)抗癲癇治療多數(shù)有效。選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑可改善患兒焦慮情緒及異常活動姿勢[14]。西甲硅油可減輕腹脹及胃食道反流，聚乙二醇3350、氫氧化鎂混懸劑可改善便秘。阿片、苯二氮類藥物可調節(jié)呼吸節(jié)律。

RTT臨床表現(xiàn)多與孤獨癥相似，為常規(guī)鑒別診斷項目，顱腦損傷或感染亦可出現(xiàn)類似癥狀，難以鑒別，本研究病例2系顱腦損傷伴RTT患者，生育典型RTT患兒（病例1），2例患者對其家庭造成了沉重負擔，故臨床疑似RTT患者應盡快進行基因篩查，以降低醫(yī)療成本，早期開始康復訓練，對高風險孕婦進行胎兒基因分析及遺傳咨詢可輔助優(yōu)生優(yōu)育。

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Clinical analysis of Rett syndrome and a research of methylation CpG binding protein-2 gene

Cheng Qin1，2，Lu Kangmo2，Kang Han2，Deng Jia2，Liu Ping2，Jiang Liping3
（1.Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Chengdu Women′s &Children′sCentralHospital，Chengdu，Sichuan610031，China；3.Immune Laboratory，Affiliated Children′s Hospital of Chongqing MedicalUniversity，Chongqing400014，China）

ObjectiveTo explore methylation CpG binding protein-2 gene mutation′s pathopoiesia effect on 4 suspected Rett syndrome（RTT）patients and gene sequencing′s significance in assist diagnosing RTT.MethodsSelected 4 suspected RTT patientsadmitted in Chengdu Women′s&Children′sCentralHospitalfrom ApriltoAugust，2014，i.e.case1，2，3，4.Case 1 was family propositus，case 2 was case 1′s mother，case 3 and 4 were sporadic patients，pedigree was successively A，B，C.Did clinical data analysis，pedigreeinvestigation，karyotypeanalysison4patients.Didpolymerasechainreactionamplification sequencingon patients andtheirparents'MECP2gene.ResultsCase1and4wereconfirmedbythelatest2010RevisedRTTdiagnosticcriteriaand geneticdiagnosis.Case 2 and 3′s clinical diagnosis was disconfirmed but virulence gene mutation was discovered.Case 1 and 2 were the first case that mother and daughter both had RTT in our country，and their MECP2 gene sequencing was the same mutation site that hasnotbeenreportedinourcountry.Pathogenicsitemutationthathasbeen reported wasdiscovered in case3 and 4′spedigree.ConclusionRTT clinical diagnosis might be different from gene diagnosis.Gene diagnosis has a great value in confirming RTT，especially those have nontypical clinical symptoms.Suspected patients can reduce medical cost，start rehabilitation training early，and assistprepotencybycompletegenediagnosisatanearlystage.

Rett syndrome； Genes； Sequence analysis； Genetic counseling； Methyl CpG binding protein 2

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.11.005

：A

：1009-5519（2015）11-1613-04

2015-03-03）

程芹（1989-），女，四川廣安人，碩士研究生，主要從事腎臟內科臨床工作；E-mail：chengqin2015@sina.com。

呂康模（E-mail：892037344@qq.com）。