李建美 李丙路 王建禮 綜述

（1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧272067；2濟(jì)南市傳染病醫(yī)院，山東 濟(jì)南250021）

急性和慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染仍然是一個(gè)重大的全球性健康問題，在全球范圍內(nèi)，有多達(dá)3．5～4億乙型肝炎患者，該病可導(dǎo)致肝硬化，是全球80%原發(fā)性肝癌的直接病因［1］。在我國，全國13億人口中有1億慢性HBV感染者，并且乙型肝炎發(fā)病率還在持續(xù)上升［2］。目前，乙型肝炎的治療策略主要是通過藥物治療長期或持久地抑制乙肝病毒復(fù)制，控制疾病的進(jìn)展，而不能治愈這種疾病。因此，新的治療選擇要有效地治愈或消滅這一疾病。本文將對乙型肝炎基因治療研究進(jìn)展作一綜述，其中特別介紹潛在的抗HBV的序列特異性DNA結(jié)合蛋白及其衍生物的設(shè)計(jì)和應(yīng)用。

1 HBV生物學(xué)

HBV是一種病毒包膜的DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，其基因組是雙鏈松弛環(huán)狀DNA（relaxed circular，rcDNA），相對分子量為（1．6～2．0）×109，全長約為312kb［3］。HBV進(jìn)入宿主細(xì)胞后，脫去包膜蛋白，釋放核心顆粒，形成rcDNA，然后進(jìn)入細(xì)胞核，rcDNA一部分雙鏈DNA由宿主酶修復(fù)形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。cccDNA作為模板，在病毒聚合酶的作用下，轉(zhuǎn)錄為pgRNA和病毒亞基因組RNA。隨后，這些病毒RNA被運(yùn)送到胞漿中。在胞漿內(nèi)，pgRNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)合成HBV rcDNA，亞基因組RNA被翻譯成病毒顆粒包裝和裝配所需的蛋白質(zhì)。新合成的HBV rcDNA一方面進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，轉(zhuǎn)化為新的cccDNA，補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)的cccDNA庫；另一方面與病毒蛋白裝配成新的完整HBV，釋放至細(xì)胞外，再感染健康的肝細(xì)胞（見圖1）［3］。由此可見，cccDNA在 HBV感染細(xì)胞過程中作為一個(gè)穩(wěn)定的微小染色體存在。

圖1 HBV感染過程

2 乙型肝炎基因治療

2．1 HBV復(fù)制周期與基因治療策略的選擇

根據(jù)HBV復(fù)制周期中的不同階段，可以采取不同的基因治療策略。在cccDNA轉(zhuǎn)錄初始階段，使用鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator－like effector nucleases，TALENs）等DNA結(jié)合蛋白切斷cccDNA雙鏈，可以阻止cccDNA的轉(zhuǎn)錄［見圖2（1）］；應(yīng)用CRISPR／Cas9酶系統(tǒng)，阻礙pgRNA的合成和延長［4］［見圖2（2）］。在cccDNA轉(zhuǎn)錄后加工階段，使用反義寡核苷酸等技術(shù)抑制HBV復(fù)制［見圖2（3）～（11）］。在cccDNA與病毒蛋白裝配階段，使用衣殼蛋白靶向病毒滅活（CTVI）方法阻礙完整HBV 的合成［5］（見圖2）。

圖2 HBV復(fù)制周期與基因治療策略

2．2 反義核酸

反義核酸技術(shù)包括反義RNA、反義寡核苷酸和核酶（ribozymes）3大技術(shù)。反義RNA通過激活RNase，抑制病毒mRNA的起始部位與啟動(dòng)蛋白及核糖體的結(jié)合，阻斷mRNA成熟等多個(gè)環(huán)節(jié)，從而阻斷 mRNA的翻譯過程。Tung等［6］將編碼HBSAg的反義和正義RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和HBV表達(dá)共轉(zhuǎn)染 Hep－G2細(xì)胞，結(jié)果顯示反義RNA共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞HBSAg表達(dá)比對照組減少了40%～50%。然而，反義RNA對cccDNA池影響不大。反義寡核苷酸技術(shù)是利用三鏈DNA的構(gòu)建來實(shí)現(xiàn)的，然而，它具有明顯的劑量依賴性，且效率低，這限制了它在乙型肝炎基因治療上的應(yīng)用。核酶是具有催化活性的特殊的反義RNA，能與靶mRNA特異結(jié)合，并催化mRNA在特定部位斷裂。但隨著研究的深入，核酶自身的某些缺點(diǎn)逐漸暴露出來，如真核細(xì)胞體內(nèi)的核酶酶切產(chǎn)物不是很穩(wěn)定，這也限制了核酶在乙型肝炎基因治療上的應(yīng)用。

2．3 CTVI

CTVI是一種有效的抗病毒策略，它將核酸酶與衣殼蛋白融合表達(dá)，從而使含有核酸酶的融合蛋白被包裝到病毒粒子中，在此降解病毒核酸。Beterams等［7］首先將CTVI應(yīng)用于乙肝病毒。他們將依賴于Ca2＋的核酸酶SN融合到HBV的衣殼蛋白C末端，形成的融合蛋白core－SN能夠像野生型衣殼蛋白一樣被組裝到病毒粒子中，從而干擾衣殼內(nèi)病毒DNA的正確合成。然而，CTVI策略存在一個(gè)難點(diǎn)，即這些核酸酶缺乏特異性，它們在干擾衣殼內(nèi)病毒DNA正確合成的同時(shí)，也對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性。

2．4 RNAi技術(shù)

RNAi能 通 過 siRNAs（small interfering RNAs）作用來關(guān)閉特定的基因表達(dá)。已有國外學(xué)者［8］通過針對HBV基因組中不同編碼區(qū)來設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA分子，并在體外培養(yǎng)細(xì)胞和HBV急性感染的小鼠模型中發(fā)揮了很好的抑制病毒復(fù)制的作用。Crowther等［9］將干擾片段表達(dá)盒（抗HBV的表達(dá)盒）導(dǎo)入細(xì)胞中能抑制HBV基因表達(dá)及病毒復(fù)制。然而，以RNAi為基礎(chǔ)的治療并不能完全消除cccDNA池，因此，RNAi為基礎(chǔ)的基因治療不能完全治愈乙型肝炎。Starkey等［10］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNAi抗HBV藥物能夠抑制病毒RNA、病毒蛋白與病毒粒子的形成，但對cccDNA池影響不大。因此，未來的RNAi抗HBV藥物研發(fā)策略重點(diǎn)應(yīng)放在cccDNA上，把cccDNA作為治療靶點(diǎn)，滅活或消除cccDNA，進(jìn)而徹底治愈乙型肝炎。

2．5 序列特異性DNA結(jié)合蛋白

圖3 序列特異性DNA結(jié)合蛋白及其衍生物

在過去的10年中，鋅指蛋白（zinc finger proteins，ZFPs）等DNA結(jié)合蛋白已被廣泛用于調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。這些DNA結(jié)合蛋白起初作為真核轉(zhuǎn)錄因子存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此，可以把他們設(shè)計(jì)成針對特定DNA序列起作用的DNA結(jié)合蛋白。目前，DNA結(jié)合蛋白已用于抑制HBV基因的表達(dá)。Zimmerman等［11］設(shè)計(jì)并合成幾種多趾ZFPs，這些ZFPs能結(jié)合鴨乙型肝炎病毒（DHBV）cccDNA增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)9或18個(gè)堿基對的序列，使pgRNA表達(dá)量降低41．6%，HBV表面蛋白、核心蛋白以及病毒粒子的合成顯著下降。然而，這些鋅指蛋白對HBV的作用是短暫的，具有時(shí)間依賴性。但是，DNA結(jié)合蛋白的應(yīng)用帶給人們治療乙型肝炎新的理念和希望。改造過的DNA結(jié)合蛋白與DNA特定序列結(jié)合，能誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（DSBs）。DSBs可以通過同源指導(dǎo)修復(fù)（HDR）和非同源末端連接（NHEJ）進(jìn)行修復(fù)［12－13］。當(dāng)沒有外源的同源序列加入時(shí)，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)NHEJ修復(fù)機(jī)制。NHEJ修復(fù)容易出錯(cuò)，易導(dǎo)致DSBs位點(diǎn)DNA序列不正確的插入、刪除和替換，往往會(huì)引入新的突變，因此，也就達(dá)到了進(jìn)行基因敲除的目的。如果此時(shí)加入外源的同源堿基序列，就可以啟動(dòng)HDR修復(fù)，利用同源修復(fù)機(jī)制，可以幫助我們實(shí)現(xiàn)基因敲除和基因修復(fù)。研究人員通過改造DNA結(jié)合蛋白，使之作用于cccDNA靶位點(diǎn)，產(chǎn)生DSBs，誘發(fā)DNA修復(fù)機(jī)制，形成基因敲除突變體，抑制 HBV 基因的表達(dá)［14－15］。目前，以cccDNA 作為靶點(diǎn)的序列特異性DNA結(jié)合蛋白及其衍生物主要有3種，一是核酸內(nèi)切酶，把一些核酸內(nèi)切酶改造成針對12～40bp DNA序列起作用的DNA結(jié)合蛋白；二是ZFPs，設(shè)計(jì)合成多趾ZFPs，每個(gè)鋅指（ZF）能綁定到一個(gè)特定的核苷酸三聯(lián)體，當(dāng)一個(gè)多趾鋅指蛋白包括4個(gè)ZF時(shí)，每一個(gè)L或R亞基的目標(biāo)是一個(gè)12bp序列；三是TALENs，把TALENs改造成靶向結(jié)合19bp DNA序列的DNA 結(jié)合蛋白［16］（見圖3）。

目前，設(shè)計(jì)和應(yīng)用比較成功的ZFPs是由Weber等［17］設(shè)計(jì)并合成的一種異二聚體ZFN，它們在細(xì)胞內(nèi)不能形成同源二聚體，這一設(shè)計(jì)最大限度地減少脫靶效應(yīng)。這種異二聚體ZFN主要靶向作用于乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）、HBcAg和聚合酶的開放閱讀框。Weber等應(yīng)用scAAV病毒載體，把異二聚體ZFN導(dǎo)入HepAD38細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)HepAD38細(xì)胞基因突變率由9．8%大幅增加至34%，同時(shí)，HBV復(fù)制關(guān)閉，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中未檢測到HBV標(biāo)志物水平明顯增加，而未導(dǎo)入異二聚體ZFN的對照組HepAD38細(xì)胞HBV標(biāo)志物水平胞內(nèi)增加30倍，細(xì)胞培養(yǎng)基上清液增加323倍［17］。因此，異二聚體ZFN能有效抑制HBV的復(fù)制。

TALENs是另一種應(yīng)用前景廣闊的核酸酶，來自一類特殊植物病原體黃單胞桿菌，具有一些比ZFNs更優(yōu)越的特點(diǎn)，現(xiàn)在已成為科研人員用于研究基因功能和潛在基因治療應(yīng)用的重要工具［18－20］。TALENs是一種嵌合蛋白，由N端核定位結(jié)構(gòu)域和C－末端的FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域組成。TALENs的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）由重復(fù)序列組成，含有重復(fù)序列可變的雙氨基酸殘基（repeat－variable diresidues，RVD）。RVD能夠識(shí)別特異性DNA堿基對。TALENs的FokI核酸酶形成二聚體特異性切割DNA序列，產(chǎn)生DSBs，誘發(fā)DNA修復(fù)機(jī)制，形成基因敲除突變體。Bloom等［21］設(shè)計(jì)并合成一組針對HBV基因組HBsAg或HBcAg表達(dá)區(qū)的TALENs。他們把靶向作用于HBsAg的TALEN導(dǎo)入HepG 2．2．15細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)約31%cccDNA發(fā)生斷裂，HBsAg分泌顯著減少；應(yīng)用尾靜脈液壓注射法，把具有復(fù)制能力的HBV DNA和HBsAg特異性的TALENs表達(dá)質(zhì)粒共同導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，與只導(dǎo)入HBV DNA相比，小鼠肝細(xì)胞HBV DNA突變率大幅增加至58%～87%，血清HBsAg水平下降90%以上，循環(huán)病毒顆粒物（VPE）減少約70%［22］。Chen等［23］聯(lián)合應(yīng)用干擾素－α和TALEN，發(fā)現(xiàn)干擾素－α和TALEN具有協(xié)同作用，能顯著抑制Huh7細(xì)胞HBV轉(zhuǎn)錄；他們應(yīng)用尾靜脈液壓注射法，把全長的單體線性HBV DNA和TALEN表達(dá)質(zhì)粒共同導(dǎo)入C3H／HeN小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，C3H／HeN小鼠血清乙肝HBsAg和cccDNA水平以及肝前基因組HBV RNA明顯下降。因此，TALENs能夠在他們的靶位點(diǎn)引入突變，降低HBV基因表達(dá)水平與cccDNA基因組數(shù)量。但是TALENs技術(shù)還存在一些問題，如TALENs蛋白可引起機(jī)體的免疫能力，TALENs還存在脫靶的問題。因此，要實(shí)現(xiàn)TALENs技術(shù)在治療乙型肝炎的廣泛應(yīng)用，在未來需要克服以上存在的問題，優(yōu)化TALENs密碼子，使其更有利于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮抗HBV作用。

由RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶CRISPR／Cas9正在被廣泛用作首選基因組編輯工具，是目前基因組工程的研究熱點(diǎn)［24－25］。CRISPR／Cas9是由 DNA切割酶Cas9和一段與靶DNA片段匹配的20個(gè)核苷酸長度的短RNA片段構(gòu)成。它的特點(diǎn)在于只需合成一個(gè)gRNA就能實(shí)現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas9蛋白不具特異性；編碼gRNA的序列不超過100bp，因此，構(gòu)建較簡單方便。與ZFPs、TALENs相比，該系統(tǒng)易于操作，能在多種細(xì)胞中進(jìn)行有效的靶向酶切，而且多個(gè)靶點(diǎn)可以同時(shí)進(jìn)行靶向酶切。Lin等［26］首次將該技術(shù)應(yīng)用于乙型肝炎基因治療的研究。他們應(yīng)用尾靜脈液壓注射法，把包含一個(gè)gRNA和Cas9表達(dá)盒的表達(dá)載體導(dǎo)入HBV小鼠模型，發(fā)現(xiàn)血清HBsAg水平顯著降低，HBV表達(dá)水平降低20%～60%。Zhen等［27］也發(fā)現(xiàn)靶定HBsAg編碼區(qū)的CRISPR／Cas9系統(tǒng)處理后，細(xì)胞培養(yǎng)基和小鼠血清HBsAg水平顯著降低，小鼠肝臟組織中HBsAg陽性細(xì)胞顯著減小。因此，CRISPR／Cas9系統(tǒng)可能是一種有效抑制HBV復(fù)制的技術(shù)。

3 結(jié)語

綜上所述，乙型肝炎基因治療策略有很多種。反義核酸在治療乙型肝炎感染有一定的優(yōu)勢，但是，它們?nèi)狈Ψ€(wěn)定性，作用不精確，限制了它們的應(yīng)用前景。RNAi作為一種高效的序列特異性基因剔除技術(shù)在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域發(fā)展極為迅速。然而，以RNAi為基礎(chǔ)的治療并不能完全消除cccDNA池，因此，RNAi為基礎(chǔ)的基因治療不能完全治愈乙型肝炎。序列特異性DNA結(jié)合蛋白及其衍生物的設(shè)計(jì)和應(yīng)用可能是乙型肝炎基因治療最有前途的方法之一，它們以cccDNA作為治療靶點(diǎn)來滅活或消除HBV。目前，序列特異性DNA結(jié)合蛋白及其衍生物的應(yīng)用的主要障礙體現(xiàn)在生產(chǎn)、載體的選擇和臨床推廣。如果序列特異性DNA結(jié)合蛋白及其衍生物能夠在臨床上推廣使用，人類就有可能完全治愈乙型肝炎。

［1］ Ott J J，Stevens G A，Groeger J，et al．Global epidemiology of hepatitis B virus infection：new estimates of age－specifi c HB－sAg seroprevalence and endemicity［J］．Vaccine，2012，30（12）：2212－2219．

［2］ 谷昊明，郭立燕，刁玉濤．某校大學(xué)生乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物檢測結(jié)果分析［J］．濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013：36（6）：431－434．

［3］ Seeger C，Mason W S．Molecular biology of hepatitis B virus infection［J］．Virology，2015，S0042－6822（15）00077－X．［Epub ahead of print］．

［4］ Lin S R，Yang H C，Kuo Y T，et al．The CRISPR／Cas9system facilitates clearance of the intrahepatic HBV templates in vivo［J］．Mol Ther Nucleic Acids，2014，3：e186．

［5］ Gebbing M，Bergmann T，Schulz E，et al．Gene therapeutic approaches to inhibit hepatitis B virus replication［J］．World J Hepatol．，2015 ，27；7（2）：150－164．

［6］ Tung F Y，Bowen S W．Targeted inhibition of hepatitis B virus gene expression：agene therapy approach［J］．Front Biosci．，1998，3：a11－15．

［7］ Beterams G，Nassal M．Significant interference with hepatitis B virus replication by a core－nuclease fusion protein［J］．J Biol Chem，2001，276：8875－8883．

［8］ Wooddell C I，Rozema D B，Hossbach M，et al．Hepatocytetargeted RNAi therapeutics for the treatment of chronic hepatitis B virus infection［J］．Mol Ther，2013，1（5）：973－985．

［9］ Crowther C，Mowa M B，Ely A，et al．Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo using helper－dependent adenovirus vectors to deliver antiviral RNAi expression cassettes［J］．Antivir Ther，2014，19（4）：363－373．

［10］ Starkey J L，Chiari E F，Isom H C．Hepatitis B virus（HBV）－specifi c short hairpin RNA is capable of reducing the formation of HBV covalently closed circular（CCC）DNA but has no effect on established ccc DNA in vitro［J］．J Gen Virol，2009，90（Pt 1）：115－126．

［11］Zimmerman K A，F(xiàn)ischer K P，Joyce M A，et al．Zinc fi nger proteins designed to specifi－cally target duck hepatitis B virus covalently closed circular DNA inhibit viral transcription in tissue culture．J Virol，2008，82（16）：8013－8021．

［12］Tong Y，Charusanti P，Zhang L，et al．CRISPR－Cas 9based engineering of achinomycetal genomes［J］．ACS Synth Biol，2015．［Epub ahead of print］．

［13］Petolino J F．Genome editing in plants via designed zinc finger nacleases［J］．In Vitro Cell Dev Biol Plant，2015，51（1）：1－8．

［14］Hsleh Y H，Chang Y Y，Su I J，et al．Hepatitis B virus pre－S2mutant large surface protein inhibits DNA donble－strard break repair and leads to genome in stability in hepato carcinogenesis［J］．S Pathol，2015．［Epub ahead of print］．

［15］Hu X，Lin J，Xie Q，et al．DNA double－strand breaks potential targets for HBV integration［J］．J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2010，30（3）：265－270．

［16］Bloom K，Ely A，Arbuthnot P．Recent advances in use of gene therapy to treat hepatitis B virus infection［J］．Adv Exp Med Biol，2015，848：31－49．

［17］Weber N D，Stone D，Sedlak R H，et al．AAV－mediated delivery of zinc finger nucleases targeting hepatitis B virus inhibits active replication［J］．PLoS One，2014，9：e97579．

［18］ Gai T，Gersbach C A，Barbas C F．IFN，TALEN and CRISPR／Cas－based methods for genome engineering［J］．Trends Biotechnol，2013，31（7）：397－405．

［19］Ain Q U，Chung J Y，Kim Y H．Current and future delivery systems for engineered naleases：IFN，TALEN and RGEN［J］．J Control Release，2015，205：120－127．

［20］Gupta R M，Musunuru K．Expanding the genetic editing tool kit：IFNs，TALENs and CRISPR－Cas9［J］．J Clin Invest，2014，124（10）：4154－4161．

［21］Bloom K，Ely A，Mussolino C，et al．Inactivation of hepatitis B virus replication in cultured cells and in vivo with engineered transcription activator－like effector nucleases［J］．Mol Ther，2013，21：（10）1889－1897．

［22］Chen J，Zhang W，Lin J，et al．An efficient antiviral strategy for targeting hepatitis B virus genome using transcription activator－like effector nucleases［J］．Mol Ther，2014，22：303－311．

［23］鄭小梅，張曉立，于建東，等．基因CRISPR－Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展［J］．生物技術(shù)進(jìn)展，2015，5（1）：1－9．

［24］陳勇龍，黃華榮，唐平平，等．基因組編輯技術(shù)－CRISPR／Cas系統(tǒng)［J］．杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，14（1）：60－65．

［25］Bortesi L，F(xiàn)ischer R．The CRISPR／Cas9system for plant genome editing and beyond［J］．Biotechnol Adv，2015，33（1）：41－52．

［26］Lin S R，Yang H C，Kuo Y T，et al．The CRISPR／Cas9system facilitates clearance of the intrahepatic HBV templates in Vivo［J］．Mol Ther Nucleic Acids，2014，3：e186．

［27］Zhen S，Hua L，Liu Y H，et al．Harhessing the clustered regularly interspaced short palindromic repeat （CRISPR）／CRISPR－associated Cas9system to disrupt the hepatitis B virus［J］．Gens Ther，2015，22（5）：404－412．