張文艷，孫寶飛，余資江＊＊＊，余彥，肖朝倫，羅時(shí)鵬，令狐艷，楊丹

(1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)550004;2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附院呼吸內(nèi)科，貴州貴陽(yáng)550004)

松樹(shù)皮提取物中含有大量原花青素(oligomeric proanthocyanidins，OPCs)的化合物，OPCs具有抗炎、抗氧化及抗血小板聚集及改善學(xué)習(xí)記憶能力作用［1-3］。海馬內(nèi)核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)在腦缺血后可被誘導(dǎo)激活，NF-κB通過(guò)調(diào)控多種基因的表達(dá)參與了多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，在缺血性腦損傷中具有重要作用。NF-κB作為腦缺血損傷的治療靶點(diǎn)，對(duì)有效防治腦缺血炎癥具有重要的理論和臨床意義［4］。目前中藥在治療腦缺血炎癥方面雖已有許多報(bào)道，但中藥作用于NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究還較少。本實(shí)驗(yàn)采用OPCs治療缺血再灌注模型小鼠，探討OPCs對(duì)缺血再灌注損傷后小鼠腦海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年昆明種小白鼠120只，體重20～22 g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(黔)2002-0001。按隨機(jī)分組原則將120只小鼠分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、14 d模型組、14 d治療組、28 d模型組和28 d治療組，每組20只。飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，濕度48%～60%。

1.2 動(dòng)物模型建立

各組小鼠常規(guī)飲食，術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。小鼠以3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒，自下頜骨到胸骨柄間作5～8 mm長(zhǎng)的頸部正中切口，游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及伴行神經(jīng)，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血15 min，然后松開(kāi)微動(dòng)脈夾，恢復(fù)血液灌注15 min，反復(fù)3次造成小鼠腦缺血再灌注損傷，蘇醒前小鼠保溫。術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素2 000 000 U肌注抗炎，分籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不夾閉頸總動(dòng)脈外，其余操作同模型組。治療組在處死前7 d給予OPCs(100 mg/kg)灌胃治療，1次/d，正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組灌注等量生理鹽水。

1.3 海馬組織炎癥因子測(cè)定

每組取10只小鼠海馬組織勻漿離心后取上清液，采用ELISA法測(cè)定腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)以及白介素-6(interleukin-6，IL-6)水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 海馬CA3區(qū)NF-κB蛋白表達(dá)

Western blot法檢測(cè)，每組各取10只小鼠斷頸處死取出全腦分離出海馬，切取雙側(cè)海馬CA3區(qū)組織，稱重，以1∶10加入4℃預(yù)冷的勻漿緩沖液后抽提核蛋白，恒溫冷凍離心機(jī)4℃，14 000 r/min離心30 min，收集上清液，Bradford法測(cè)定蛋白含量，加等體積的2×電泳樣品緩沖液混合，以1 g/L蛋白量上樣，10%SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜，膜片以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(NF-κBp65單克隆抗體)4℃過(guò)夜，洗滌后與二抗-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)交聯(lián)物反應(yīng)，強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色劑顯色，以柯達(dá)醫(yī)學(xué)專(zhuān)用膠片曝光，手工顯影、定影、洗片，顯現(xiàn)特定的蛋白信號(hào)條帶。BIO-RAD生物圖像處理系統(tǒng)(PDQUEST 6.1.1)進(jìn)行灰度測(cè)定。按目的蛋白灰度值與相應(yīng)β-actin灰度值計(jì)算每例標(biāo)本相應(yīng)指標(biāo)的相對(duì)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 11.5軟件處理，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

造模后觀察到模型組小鼠出現(xiàn)驚厥、呼吸深慢、心跳加快等腦缺血模型特異性表現(xiàn)。表明造模成功。

2.2 海馬組織中NF-α、IL-6蛋白表達(dá)

ELISA結(jié)果顯示，假手術(shù)組與正常對(duì)照組結(jié)果無(wú)差異(P＞0.05)，各模型組小鼠TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組中，14 d組升高更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P＜0.05)，各治療組TNF-α、IL-6水平低于同期模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 海馬組織CA3區(qū)NF-κB蛋白表達(dá)

假手術(shù)組海馬CA3區(qū)NF-κB蛋白水平與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各模型組NF-κB蛋白水平顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各治療組低于同期模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-6及NF-κB蛋白表達(dá)Tab.1 The protein expressions of TNF-α，IL-6 and NF-κB in hippocampal tissues of mice in each group

圖1 各組小鼠海馬組織CA3區(qū)NF-κB蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.1 Expressions of NF-κB in CA3 region in hippocampal tissues of mice in each group

3 討論

腦缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury)引起缺血組織一系列復(fù)雜的病理生理變化，涉及自由基產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、炎性細(xì)胞因子損害和細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面。NF-κB是一類(lèi)具有多向調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血時(shí)，可被特異性激活，從而調(diào)控多種基因的表達(dá)，參與免疫、炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多種病理生理過(guò)程，與缺血再灌注損傷關(guān)系密切［5］。NF-κB存在于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，是由p50和p65兩個(gè)亞單位組成的異二聚體。NF-κB未激活時(shí)與抑制蛋白IκB結(jié)合后位于胞質(zhì)，在某些刺激因素作用下IκB降解，并與NF-κB解離后被激活，進(jìn)入胞核與特定基因啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄［6］。多種炎癥遞質(zhì)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中包含κB位點(diǎn)，如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-12、血管細(xì)胞黏附分子-1、干擾素-γ等，這些因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)，最終促使神經(jīng)細(xì)胞從早期缺血到細(xì)胞死亡的不可逆損害演變，加重腦損傷，炎性細(xì)胞因子在缺血再灌注后所引發(fā)的繼發(fā)性損傷起關(guān)鍵作用［6］。

腦缺血早期TNF-α分泌的增加是缺血再灌注損傷形成的主要原因［7］，TNF-α又可誘導(dǎo)IL-6的合成。本研究證實(shí)腦缺血后NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高，14 d模型組高于28 d模型組，可能與機(jī)體自身修復(fù)有關(guān)，提示NF-κB是腦缺血再灌注損傷炎癥機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵性因子，在腦缺血中發(fā)揮重要作用。在腦缺血再灌注損傷后TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示腦缺血再灌注后損傷機(jī)制可能與此有關(guān)。

從松樹(shù)皮中提取的OPCs是一種多酚類(lèi)復(fù)合物，含量一般為80%左右，OPCs通過(guò)抗氧化、抗凋亡等途徑發(fā)揮改善腦缺血再灌注損傷的作用［8-11］。李建玲等［12］研究發(fā)現(xiàn)，OPCs可以通過(guò)下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3對(duì)腦缺血產(chǎn)生保護(hù)作用。楊東斌［13］發(fā)現(xiàn)OPCs能夠明顯改善腦缺血再灌注損傷，IL-6和內(nèi)皮素-1可能與其減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究采用OPCs治療腦缺血再灌注損傷小鼠后，蛋白印跡結(jié)果顯示海馬CA3區(qū)NF-κB蛋白水平與同期模型組比較均降低，炎性因子TNF-α和IL-6水平均較同期模型組小鼠低，說(shuō)明OPCs治療對(duì)核因子NF-κB的表達(dá)具有明顯的抑制作用，對(duì)小鼠缺血再灌注產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用。提示如能通過(guò)某些方法、途徑或藥物來(lái)抑制NF-κB的激活，可有效地預(yù)防和治療腦缺血再灌注損傷。抗NF-κB產(chǎn)生可能為預(yù)防和治療腦缺血再灌注損傷提供一個(gè)新的思路和途徑。

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