——以安徽工程大學為例

徐曉平1，陳延松2

(1.安徽工程大學 建筑工程學院，安徽 蕪湖 241000；2.合肥師范學院 生命科學學院，安徽 合肥 230601)

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微型生物輪蟲在水處理生物學實驗教學中的應用

——以安徽工程大學為例

徐曉平1，陳延松2

(1.安徽工程大學 建筑工程學院，安徽 蕪湖 241000；2.合肥師范學院 生命科學學院，安徽 合肥 230601)

[摘要]水處理生物學是高等學校給排水科學與工程專業(yè)必修的專業(yè)基礎課程，該課程傳統實驗教學中常包括大量的微生物培養(yǎng)和觀察項目，實驗操作難度相對較大。為了克服這個問題，我們選擇使用具有易培養(yǎng)、繁殖快等特點，且在給水和排水處理系統中常見的一類微型水生生物輪蟲作為水處理生物學實驗課程的主要實驗教學材料，并初步篩選了5個實驗項目。實驗教學表明微型水生生物輪蟲在水處理生物學實驗教學中具有重要的應用價值。

[關鍵詞]輪蟲；水處理生物學；實驗教學

水處理生物學是高等學校給排水科學與工程專業(yè)的專業(yè)基礎課之一，課程學習目的是讓學生理解和掌握與水處理相關的微生物的基本概念、基本理論、實驗方法以及在給水排水工程中的實際應用方面的知識，提升學生綜合素質和創(chuàng)新能力，鍛煉學生理論聯系實際的能力，為今后從事城市給水排水工程、工業(yè)水處理工程、環(huán)境治理和管理等方面的工作奠定堅實的基礎。實驗教學是把理論的、抽象的知識具體化，實現對理論的深層次理解，培養(yǎng)學生的動手能力。因此，水處理生物學實驗教學開展的好壞直接影響到這門課程的教學效果。由于給排水科學與工程專業(yè)學生普遍比較缺乏生物學知識，課程所涉及的生物種類多(有微生物、小型動物和大型植物)、范圍廣、形態(tài)多樣，而且很多微型生物存在取材難、培養(yǎng)難、觀察難等問題，所以，選擇合適的微型生物種類作為教學材料關系到實驗教學的效果。我們根據我院實驗室的實際情況，選擇微型生物——輪蟲作為一種主要的一種教學材料，整合了實驗教學內容，收到了較好的教學效果。

1輪蟲及其在水處理過程中的出現情況

輪蟲(rotifer)是體型最小的一類多細胞動物，其大小一般在100-1000μm之間，最小的僅有40um左右，最大的可達4mm。輪蟲的體型多為縱長形，一般分為頭、軀干和尾三部分。頭部較寬，具有由1-2圈纖毛組成的頭冠(corona)，頭冠的形式不一，有些種類的頭冠上半部完全裂開，形成2個纖毛輪器(trochus)，纖毛擺動時形似車輪，故稱輪蟲。輪蟲廣泛分布于各類水體中，是浮游動物四大類群之一。目前全世界已被描述的輪蟲種類達2000種以上，我國已報道的輪蟲亦已超過400種，在已報道的輪蟲中，95%為淡水種類，其中75%的種類營附著生活且大多分布于沿岸帶，真正營浮游生活的種類僅有100種左右。雖然輪蟲的個體在所有后生動物中為最小，但其繁殖速率卻是最快，因此它們能夠迅速占領環(huán)境中的空生態(tài)位，并將初級生產量(藻類和細菌等)轉化成次級消費者(昆蟲、甲殼動物和魚類幼體)可利用的形式，其轉換效率極高，以至于總浮游生物現存量的30%由其產生。因此，輪蟲在淡水水體生態(tài)系統結構功能、能量傳遞及物質轉換上具有重要意義 。

1.1 輪蟲在給水處理中的出現

給水系統中無脊椎動物的出現直接影響到出水水質，引起人們的高度關注。Schreiber等人[1]在顆粒活性炭(GAC)池中無脊椎動物的孳生研究中，指出濾池出水中無脊椎動物總豐度可高達6800個/m3，輪蟲是炭池出水中占主導地位的無脊椎動物，占到了總數的97%。李小偉等[2]對南方某水廠炭池中無脊椎動物的種群進行了為期13個月的調查，研究發(fā)現，炭池中無脊椎動物共為3綱23種(類)，炭池濾后水中無脊椎動物密度最高可達825個/m3，主要為輪蟲(58%-100%)，優(yōu)勢種類有單趾輪蟲(36%)、鞍甲輪蟲(26%)、狹甲輪蟲(10%)、腔輪蟲(7%)、蛭態(tài)目(5%)等。劉麗君等[3]在中試模擬炭柱上對生物活性炭(BAC)吸附池無脊椎動物的孳生繁殖以及群落變化規(guī)律進行了為期1年的研究，研究結果表明，性炭吸附柱中孳生的無脊椎動物中輪蟲是占絕對優(yōu)勢的類群。尹文超等[4]添加一系列不同粒徑和不同高度的砂墊層于5根活性炭濾柱中，在10個月的連續(xù)運行期間，濾柱出水中共檢出7類無脊椎動物，其中輪蟲為優(yōu)勢種群。

1.2輪蟲在廢水處理中的出現

輪蟲在活性污泥廢水處理系統正常運行時期、有機物含量較低以及出水水質良好時才會出現，故輪蟲的存在說明處理效果較好。然而，有時處理系統因污泥齡較長、負荷較低，污泥因缺乏營養(yǎng)而老化解絮，這時輪蟲可因污泥碎屑增多而大量繁殖，1毫升污泥混合液中可多至近萬個輪蟲，這是污泥老化解絮標志。污泥中常見的有玫瑰旋輪蟲和豬吻輪蟲，特別是后者的大量繁殖會將活性污泥蠶食光，造成污水處理失敗，為避免此類現象發(fā)生，當鏡檢到豬吻輪蟲有大量繁殖的趨勢時，為了保持正常運行，可暫時停止曝氣，制造厭氧環(huán)境抑制豬吻輪蟲生長。此外，大多數輪蟲以細菌、霉菌、藻類、原生動物及有機顆粒為食，因此，輪蟲的出現對于活性污泥中微型生物種群之間關系的調節(jié)起到重要作用[5]。

2輪蟲在水處理生物學教學中的使用

我們實驗教學中所用的輪蟲，包括萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)、旋輪蟲(Philodinasp.)和豬吻輪蟲(Dicraniphorussp.)等，均采自蕪湖市汀棠湖(119°21'E, 31°20'N)，實驗室內在25±1℃、自然光照條件下進行培養(yǎng)；所用輪蟲培養(yǎng)液采用EPA配方[6]，所用餌料由HB-4培養(yǎng)基[7]培養(yǎng)的、處于指數增長期的斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)，離心濃縮后使用。

我們所用教材是顧夏聲主編的《水處理生物學》(第5版)，其中“第4篇-微生物學的研究方法”中涉及到可以使用輪蟲以及斜生柵藻作為實驗材料的實驗教學環(huán)節(jié)有：顯微鏡使用及微生物形態(tài)的觀察、微型動物的計數、培養(yǎng)基的制備和滅菌、藻類生長及其抑制實驗、生物毒性檢測等。下面分別作介紹：

2.1顯微鏡的使用和微生物形態(tài)的觀察

該實驗的目的是讓學生掌握普通光學顯微鏡的使用方法，認識活性污泥中出現的原生動物和微型生物，并學習測量微生物大小的方法。我們的做法是：從單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的輪蟲的燒杯中分別吸取一滴滴到載玻片上，不蓋蓋玻片，讓學生低倍鏡下尋找水滴中的活動的輪蟲，這一過程中讓學生了解并掌握顯微鏡的使用方法。之后，蓋上蓋玻片，制備微生物標本玻片，在選定的接目鏡下，利用低倍鏡，確定目測微尺一格的長度(單位以微米計)，畫出所見輪蟲的草圖，并量出其中一個輪蟲的尺寸。記下觀察所使用的接目鏡和接物鏡的放大倍數和算出顯微鏡的放大倍數。接下來改用高倍鏡，更加清楚地觀察輪蟲形態(tài)和內部構造，畫出形態(tài)草圖，并與用低倍鏡所看到的比較，記下顯微鏡的放大倍數。

2.2微型動物的計數

教材中設計的從活性污泥法曝氣池混合液中取樣計數，目的是讓學生測定活性污泥法曝氣池混合液中微型動物的數目，但實際操作過程中，可能受到污泥培養(yǎng)效果的好壞影響，導致樣品中微型生物的較少，為了使學生更好地掌握計數方法，我們在取樣活性污泥之前，先從輪蟲培養(yǎng)液中定量抽樣(根據實際可以選擇用甲醛固定)，在微型動物計數板或者直接滴到載破片上進行全計數，進而根據抽樣情況反推培養(yǎng)液中輪蟲的實際密度，同樣的方法還可以開展斜生柵藻的抽樣計數。在掌握上述計數方法后，再讓學生取活性污泥進行觀察計數。

2.3培養(yǎng)基的制備和滅菌

該實驗設計的目的是讓學生學會玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準備工作，掌握培養(yǎng)基配制和無菌水制備的方法。輪蟲培養(yǎng)基我們使用的美國國家環(huán)保局的配方[6]，具體配方是：每升蒸餾水中96mg碳酸氫鈉、60mg硫酸鈣、60mg硫酸鎂以及4mg氯化鉀。培養(yǎng)斜生柵藻所用的培養(yǎng)基是HB-4培養(yǎng)基(章宗涉和黃祥飛, 1991)，具體配方是：每10L蒸餾水中2.0g硫酸銨、0.15g磷酸氫二鉀，0.15g無水氯化鈣，0.8g硫酸鎂、1.0g碳酸氫鈉、0.25g氯化鉀、5ml土壤浸出液、10mlA5液、1.5ml三氯化鐵(1.5%)溶液。這兩種培養(yǎng)基均需高壓滅菌后方可使用。此外，斜生柵藻在培養(yǎng)過程中，需要每天進行擴大接種，接種需在無菌環(huán)境中操作。因此，學生在完成上述操作過程中即可掌握電子天平的使用、無菌水的制備、滅菌以及無菌操作等技術。

2.4藻類生長及其抑制實驗

實驗目的是讓學生掌握藻類的培養(yǎng)方法，學習藻類檢測毒物的方法。我們采用投喂輪蟲所用的斜生柵藻開展此項實驗，藻種購置中國科學院水生生物研究所。斜生柵藻的培養(yǎng)采用半連續(xù)培養(yǎng)法，具體做法是：用無菌操作法從瓊脂斜面上跳取適量健壯藻種，接種到盛有200mlHB-4培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，置于恒溫光照生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度控制在25℃±1，光照4000-4500lx，每天光照時間為光/暗為16/8。自接種之日起，每天早中晚輕搖培養(yǎng)瓶3次。第2、3、4天分別加100mlHB-4培養(yǎng)基，第5天離心收集。離心條件是3500-4000轉/分鐘，離心結束后棄去上清液，應用細胞計數板抽樣收集的藻細胞液在顯微鏡下計數，確定藻細胞濃度。

生長抑制試驗我們采用硫酸銅作為毒物，逐級稀釋成含Cu2+濃度為0.00001、0.0005、0.001、0.005、0.01mg/L和空白對照(即0mg/L)的測試液各200ml，吸取計數過的藻母液分別投入到上述測試液中，使起始藻細胞密度為0.1×106個/ml，之后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程與上述接種培養(yǎng)過程一致，第2、3、4、5每天從培養(yǎng)瓶中抽樣1ml進行計數，每次一個瓶重復抽樣3次，取平均值。最后根據記錄數據計算藻的最大單位生長率，計算公式見顧夏聲主編的《水處理生物學》P386頁，并對硫酸銅的毒性進行評定。

2.5生物毒性檢測

由于工業(yè)廢水性質復雜，其中不少有毒物質很難用化學方法測得，且這些物質往往之間會發(fā)生復雜的相互作用，作用結果常很不易通過化學定量來表征，因此，需要開展生物毒性實驗來檢測廢水綜合毒性。我們教材中建議的實驗材料是魚類，但是魚類存在難培養(yǎng)、敏感度不夠以及成本大等特點。輪蟲具有分布廣泛、繁殖迅速、世代時間短、易培養(yǎng)以及存活、繁殖和行為等對環(huán)境理化因子的變化敏感等優(yōu)點，因此在水生態(tài)毒理學研究和水環(huán)境監(jiān)測中日益受到研究者的青睞[8]。美國國家環(huán)保局將萼花臂尾輪蟲和褶皺臂尾輪蟲(B.plicatilis)分別作為淡水和海水污染的測試生物列入了國家測試標準[9]。

我們開展此項實驗的具體做法是：第一步，廢水取樣，取工業(yè)廢水和污水處理廠不同工藝段的出水，進行常規(guī)理化分析后冷藏保存。第二步，實驗前逐級稀釋廢

水樣品，按照廢水與輪蟲培養(yǎng)液體積比逐級稀釋，如100%、75%、50%、25%等作為測試液，同時設置空白對照(即0%)。取5ml測試液于小燒杯中，每個處理組設置3個平行，每個小燒杯中放入10個輪蟲(齡長在10小時之內)，24小時和48小時后觀察輪蟲存活情況，記錄并計算對輪蟲產生影響的半數效應濃度(Median effective concentration，EC50)和最低無稀釋效應濃度(Lowest ineffective dilution，LID)，并據此推測廢水綜合毒性[10]。

上述可見，輪蟲作為在給水和排水系統中常見的一類微型生物，它容易取材和培養(yǎng)、操作簡單，通過整合實驗內容，在水處理生物學實驗教學中可以有著很好的應用；而且，作為一種理想的實驗材料，在教師科研中也有著較好的應用[11]，值得進一步推廣使用。

[參考文獻]

[1]Scheriber H., Schoenen D., Traunspurger W. Invertebrate colonization of granular activated carbon filters [J]. Water Research, 1997, 31(4): 743-748.

[2]李小偉, 劉麗君, 楊宇峰. BAC濾池水生動物的控制研究[J]. 給水排水, 2007, 33(11): 7-12.

[3]劉麗君, 張金松, 李小偉, 安娜, 喬鐵軍. 生物活性炭吸附池無脊椎動物群落變化及對水質影響[J]. 給水排水, 2010, 36(4): 7-11.

[4]尹文超, 張金松, 劉麗君, 趙巖, 李拓, 林超. 砂墊層控制活性炭濾池無脊椎動物穿透研究[J]. 哈爾濱工業(yè)大學學報, 2013, 45(2): 41-46.

[5]顧夏聲, 胡洪營, 文湘華, 王慧. 水處理生物學(第5版)[M]. 北京：中國建筑工業(yè)出版社, 2011.

[6]USEPA, 1985. Methods for measuring the acute toxicity of effluents to freshwater and marine organisms. In: Peltier WH, Weber CI (eds) EPA/600/4-85/013 [M]. US Environment Protect Agency, Washington DC, p 216.

[7]章宗涉, 黃祥飛. 淡水浮游生物研究方法[M]. 北京：科學出版社, 1991, 410-411.

[8]Dahms H.U., Hagiwara A., Lee J.S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers [J]. Aquatic Toxicology, 2011, 101: 1-12.

[9]ASTM. Standard guide for acute toxicity tests with the rotiferBrachionus. Annual book of ASTM standards vol. 11.04, E1440 [M]. Philadelphia, PA, USA: American Society for Testing and Material, 1991.

[10]周永欣, 章宗涉. 水生生物毒性試驗方法[M]. 北京：農業(yè)出版社, 1989, 109-133.

[11]Xu XP., Xi YL., Chu ZX., Xiang XL. Effects of DDT and dicofol on population growth ofBrachionuscalyciflorusunder different algal (Scenedesmusobliquus) densities [J]. Journal of Environmental Biology, 2014, 35(5): 907-916.

[中圖分類號]G61

[文獻標識碼]B

[文章編號]1674-2273(2015)06-0098-02

作者簡介][第一 徐曉平(1979 - )，男，安徽當涂人，安徽工程大學建筑工程學院講師，博士，研究方向：水污染生態(tài)學。

[基金項目]安徽工程大學青年科研基金(2015YQ01)

[收稿日期]2015-06-18