張秀義

·基礎研究·

血管內皮生長因子激酶功能區(qū)受體基因沉默抑制肺癌A549細胞增殖并增強其對多西他賽的敏感性

張秀義

目的研究沉默血管內皮生長因子激酶功能區(qū)受體(kinase-domain insert containing receptor,KDR)基因對人肺癌A549細胞增殖以及對化療藥物多西他賽敏感性的影響。方法設計合成KDR的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)序列，LipofectamineTM2000轉染入A549細胞。通過反轉錄-聚合酶鏈反應和Western Blot檢測KDR基因沉默后KDR mRNA及蛋白的表達情況，利用流式細胞儀檢測A549細胞的周期變化。采用四甲基偶氮唑鹽比色法及細胞克隆形成實驗觀察，沉默KDR基因后A549細胞對多西他賽的敏感性。結果KDR基因經48 h沉默后，A549細胞的KDR基因和蛋白的表達出現較明顯的下降(P<0.05)。A549細胞的周期在G0/G1期阻滯，S期細胞數目減低(P<0.05)。在KDR基因沉默組，A549細胞對多西他賽的敏感性有明顯的增強(P<0.05)。結論KDR-siRNA能夠明顯沉默A549細胞KDR基因和蛋白的表達，并能抑制A549細胞的增殖，增強其對多西他賽的敏感性。

血管內皮生長因子激酶功能區(qū)受體；小干擾RNA；肺癌；A549細胞；細胞增殖；多西他賽

在全世界范圍內肺癌的發(fā)病率最高，且發(fā)病過程是一個多因素、多步驟的漸進過程，已經嚴重威脅到人類的健康[1-3]。近些年來，隨著人類基因組計劃的完成和功能基因學的不斷發(fā)展，人們發(fā)現腫瘤細胞的增殖、遷移與基因的調控有關，涉及多種基因復雜的激活、失活，為臨床提供了新的有效治療腫瘤途徑[4-6]。研究發(fā)現，血管內皮生長因子激酶功能區(qū)受體(kinase-domain insert containing receptor,KDR)基因在肺腺癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤治療的新靶點[7-8]。KDR是介導血管內皮生長因子在腫瘤新生血管形成中發(fā)揮功能的特異性受體，與惡性腫瘤的增生有關。本研究將合成的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉染入肺癌A549細胞，分析siRNA對KDR基因沉默的效率；研究沉默KDR基因后，腫瘤細胞周期的變化及其對多西他賽敏感性的影響,為RNA干擾KDR基因治療肺癌或作為增敏藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌A549細胞購自南京凱基生物科技有限公司；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s meuium,DMEM)、無血清Opti-MEM培養(yǎng)基(伊格爾最低限度必需介質培養(yǎng)基改良型)、G418培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自杭州四季青公司；脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000和TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain rea-ction，RT-PCR)兩步法試劑盒購自大連TaKaRa公司，禽成髓細胞瘤病毒反轉錄試劑盒由重慶將來試劑公司提供；互補DNA(complementary DNA，cDNA)合成試劑盒購自日本TOYOBO公司；RNA干擾序列購自廣州銳博生物科技有限公司；PCR引物序列為美國Invitrogen公司化學合成；細胞計數試劑盒購自上海炎彬化工科技有限公司；鼠抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體、兔抗人KDR多克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標志的兔抗羊免疫球蛋白G購自美國Invitrogen公司；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)購自美國Bio-Rad公司；二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、放射免疫沉淀分析蛋白裂解液購自北京賽百盛基因技術有限公司；電化學發(fā)光(electrochemical luminescence，ECL)試劑盒購自美國Invitrogen公司；Matrigel凝膠購自美國BD公司；全自動酶標儀購自美國Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA設計、合成及轉染 依據文獻[9]KDR-siRNA、陰性對照組siRNA SCR(scramble siRNA)序列分別為正義鏈5′-GCCACCAUGUUCUCUAAUATT-3′和反義鏈5′-UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT-3′、正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′和反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；肺癌A549細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM中，于37 ℃恒溫、5% CO2、飽和濕度的密閉式孵箱內培養(yǎng)，擴增傳代。取對數生長期的細胞用于實驗。按每孔2×105個將A549細胞接種于6孔板中，當融合率達80%時通過脂質體法進行細胞轉染。轉染時分為3組：轉染pGenesil-1-KDR-siRNA載體為A549/KDR-siRNA組(實驗組)，轉染siRNA載體為A549/control組(對照組)，未轉染的肺癌A549細胞為A549組(空白組)。于轉染后48 h進行RNA干擾效應的檢測。

1.2.2 半定量RT-PCR檢測 棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌細胞3次，TRIzol法提取細胞總RNA，經cDNA合成試劑盒反轉錄合成cDNA。分別擴增KDR和內參GAPDH。KDR正義鏈5′-CTGGCATGGTCTFCTGTGAAGCA-3′，反義鏈5′-AATACCAGTGGATGTGATGCGG-3′，擴增產物795 bp；內參照GAPDH正義鏈5′-CGTGGAAGGACT CATGACCA-3′，反義鏈5′-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3′，擴增產物為509 bp。PCR反應條件為94 ℃變性2 min，按94 ℃變性45 s、62 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min進行反應，循環(huán)35次，再于72 ℃延伸8 min。用2%瓊脂糖水平板電泳，經100 V電壓電泳45 min。用凝膠自動成像及分析系統(tǒng)，以KDR/GAPDH光密度值(optical density，OD)作為mRNA表達的相對強度。

1.2.3 Westem Blot檢測 棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗細胞3次，并提取總蛋白，經BCA法測定蛋白質濃度，吸取50 μg總蛋白，去離子水補至20 μL，置入等體積2×上樣緩沖液，99 ℃變性10 min。離心，取50 μg蛋白行電泳，電轉移印跡到PVDF上，封閉液中孵育1 h；加入1∶1 000稀釋的KDR一抗4 ℃過夜；0.01 mmol/L TBST(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、150 mmol/L NaCl、8 mmol/L疊氮鈉、0.01%吐溫-20,pH 7.5)洗膜5 min，共3次；加入1∶5 000 HRP標志的二抗及GAPDH，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌，并采用ECL法檢測。暗室曝光X線片后，經Uvitec公司凝膠成像系統(tǒng)攝像，采用Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶的OD，以KDR/GAPDH代表KDR的相對表達量。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 收集每組的A549細胞，將細胞調整為1×106/L，再經PBS沖洗2次后，細胞沉淀用4 ℃的70%冷乙醇混勻后備用，洗滌細胞，后再用PBS調整細胞為1×106/L與含50 μg/mL RNA酶的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH 7.4)共同孵育30 min。100 μg/mL碘化丙啶進行細胞的DNA染色，在暗室中置1 h后經過流式細胞儀檢測得A549細胞的DNA含量分布，并且計算出每個周期細胞的百分率。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽比色法檢測沉默KDR后A549細胞對多西他賽的敏感性 細胞轉染KDR-siRNA 48 h以后，收集各組的A549細胞，并將其接種到96孔板中，每個樣本設立3個復孔，待細胞貼壁后，分別加入多西他賽(6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)培養(yǎng)48 h后，每孔加入四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)]20 μL(質量濃度為5 mg/mL)，放置于孵箱內4 h后棄掉上清液后再將其加入到10%的十二烷基磺酸鈉200 μL中過夜。將其震蕩15 min，用全自動酶標儀檢測570 nm處的OD(OD570)。抑制率(%)=[(OD570對照組-OD570實驗組)/(OD570對照組-OD570空白組)]×100%。

1.2.6 平板克隆檢測沉默KDR后的A549細胞對多西他賽的敏感性 細胞在轉染KDR-siRNA 48 h后，將各組A549細胞進行收集，并接種置6孔板，每個樣本設立3個復孔，等細胞出現貼壁后，將其分別加入多西他賽(6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d，棄掉培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次，經95%乙醇固定10 min后，再經吉姆薩染液染色10 min后沖洗、晾干，根據下面的公式，用Quantity One軟件計算克隆形成的抑制率?？寺⌒纬梢种坡?%)=[1-(實驗組克隆數/對照組克隆數)]×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0軟件，計量資料組間比較行單因素方差分析，2組間的連續(xù)變量比較采用t檢驗，多組間的連續(xù)變量比較采用方差分析方法、協方差校正，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KDR-siRNA抑制KDR mRNA的表達 KDR mRNA表達的RT-PCR檢測與對照組、空白組比較，實驗組條帶明顯變窄，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

2.2 siRNA抑制KDR蛋白的表達 KDR蛋白表達的Western Blot檢測與對照組、空白組比較，實驗組條帶顯著變窄，其OD比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2)。

圖1 RT-PCR檢測A549細胞中KDR mRNA的表達

圖2 Western Blot檢測A549細胞中KDR蛋白的表達

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 經流式細胞儀分析A549細胞的周期，結果顯示實驗組在G0/G1期阻滯，S期細胞數目減低，實驗組與對照組、空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，G2/M期細胞沒有顯著的變化(P>0.05)，見表1。

表1 siRNA抑制KDR表達對A549細胞周期的影響

注：與空白組、對照組比較，*P<0.05

2.4 干擾KDR后A549細胞對多西他賽的敏感性

經MTT法檢測轉染pGenesil-1-KDR-siRNA后，A549細胞對不同濃度的多西他賽敏感性均提高。隨著藥物濃度的增強，多西他賽對A549細胞的抑制率也有增加，呈現出一定的劑量依賴性，實驗組A549細胞對不同濃度的多西他賽敏感性明顯高于空白組和對照組(P<0.05，表2)。

2.5 對A549細胞集落形成的影響 經平板克隆檢測顯示，pGenesil-1-KDR-siRNA轉染后，A549細胞對不同濃度的多西他賽敏感性均有提高，細胞克隆形成數出現顯著的減少，克隆形成抑制率也顯著提高(P<0.05)。隨著多西他賽藥物濃度的增強，其對細胞克隆形成的抑制率也有增加，并且顯示出劑量依賴性，實驗組A559細胞對不同濃度的多西他賽克隆形成抑制率明顯高于空白組和對照組(P<0.05，表2)。

表2 多西他賽對A549細胞增殖及A549細胞克隆形成抑制率

注：與空白組、對照組比較，*P<0.05

3 討論

隨著肺癌發(fā)病率的逐年上升、發(fā)病年齡的逐漸年輕化，人類健康受到了嚴重的威脅[10-12]。有研究認為，腫瘤發(fā)病主要原因是細胞增殖過度及細胞凋亡受抑制、死亡不足，致使病變組織內腫瘤細胞存活時間延長，細胞群體內存活與死亡的平衡遭到了破壞，出現存活大于死亡、腫瘤細胞數目的凈增長加大的不平衡現象[13]，據此想辦法阻止腫瘤細胞的增殖就成為了新的一種治療方向。近些年來，隨著人類基因組計劃的完成和功能基因科學的快速發(fā)展，腫瘤基因方面的治療得到醫(yī)學界廣泛的重視。肺癌細胞的增殖、侵襲及遷移中涉及眾多基因結構和功能異常，明確關鍵基因對肺癌發(fā)病中起的作用,對臨床診斷、治療及預防肺癌意義重大。

RNA干擾技術的快速發(fā)展，為腫瘤基因的治療提供了基礎，近年來已成為研究熱點[14-16]。研究發(fā)現，KDR在細胞生長和分化中起著關鍵的作用，因為KDR可以自分泌形式直接作用于腫瘤細胞，抑制細胞的增殖，并促進細胞凋亡[17]。本實驗基于腫瘤與正常組織中KDR的表達所具有的差異特點，設計并合成KDR-siRNA序列，LipofectamineTM2000轉染A549細胞。實驗結果表明，在轉染細胞24 h后實驗組顯示出較明顯的生長抑制,48 h后呈現明顯的抑制作用。

本實驗通過小分子KDR干擾RNA采用流式細胞儀檢測A549細胞周期，結果顯示阻滯在G0/G1期，S期的細胞數目減低，并且有腫瘤生長停滯的現象；多西他賽對沉默KDR后A549細胞的敏感性有顯著增強作用，表明KDR被沉默后細胞的分裂增殖可有效降低，并使肺癌細胞對化療藥物的敏感性增強。本實驗研究結果表明，小分子KDR干擾RNA沉默KDR基因可有效抑制細胞增殖，并能增強肺癌A549細胞對化療藥物的敏感性，這可為惡性腫瘤的治療或輔助治療提供新的思路和研究方向。

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Kinase-domain insert containing receptor gene silencing inhibited proliferation of human lung cancer cell line A549 and enhanced their sensitivity to docetaxel

ZHANGXiuyi

(Department of Respiratory, Chengde Central Hospital, Chengde Hebei 067000, China)

Objective This study investigated the effect of small interfering RNA-mediated kinase-domain insert containing receptor (KDR) knock-down on proliferation of human lung cancer cell line A549 and their sensitivity to docetaxel. Methods The small interfering RNA (siRNA) against KDR was constructed and transfected into A549 cells with LipofectamineTM2000. The expre-ssion of KDR was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction and Western Blot. Flow cytometry was used to detect the cell cycle. Sensitivity to docetaxel after transfection were exa-mined by methyl thiazolyl tetrazolium assay and clonogenic assay. Results In A549 cells， the protein and mRNA levels of KDR were decreased significantly after transfection，and reduction of proli-feration was related to an increase in the fraction of G0/G1 phase. The sensitivity of A549 cells to docetaxel was increased significantly after transfection. Conclusion The KDR special siRNA silenced KDR，decreased A549 cells proliferation and enhanced their sensitivity to docetaxel.

Kinase-domain insert containing receptor (KDR); Small interfering RNA (siRNA); Lung cancer; A549 cells; Cell proliferation; Docetaxel

067000 河北 承德，承德市中心醫(yī)院呼吸內科(張秀義)

R734.2；R979.1

A

2095-3097(2015)03-0133-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.03.002

2014-12-01 本文編輯：徐海琴)