趙鳳綿 戚海 張愛紅 牛宏偉 韓衛(wèi) 劉敬閃 李建民 陳筱麟 張金彩 陳紅霞

目前，我國臨床應(yīng)用的濃縮血小板以單采血小板為主，隨著臨床對(duì)單采血小板需求量的飆升，血站與臨床的供需矛盾越來越凸顯，科學(xué)合理、安全有效利用手工采集全血中血小板資源、緩解單采血小板供應(yīng)不足的問題是血站亟需考慮的問題。因從單袋全血中提取單人份手工血小板的血小板含量低，患者需要輸注數(shù)袋才能達(dá)到血小板的治療效果，輸注過程繁瑣，反復(fù)穿刺易交叉感染，不能濾除白細(xì)胞易導(dǎo)致由白細(xì)胞引起的輸血反應(yīng)等等，諸多弊端限制了手工血小板在臨床應(yīng)用。歐洲國家普遍輸注混合濃縮血小板，甚至有些國家混合濃縮血小板在臨床占有絕對(duì)的比例。為滿足臨床輸注血小板的需求，綜合利用手工采集全血中的血小板資源，進(jìn)一步提升血小板的質(zhì)量和更理想的提高手工血小板的治療效果，我們開展了利用匯集白膜層方法、用單人份男性獻(xiàn)血者血漿作為懸浮介質(zhì)、制備去白混合濃縮血小板研究，為我國建立手工濃縮血小板的匯集、濾除白細(xì)胞的操作規(guī)程和標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我中心符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》、2011年10月至2012年2月共計(jì)445名隨機(jī)獻(xiàn)血者捐獻(xiàn)的400 ml/袋全血。

1.2 設(shè)備與試劑 (1)日本久保田KUBOTA994L大型離心機(jī);(2)泰爾茂SC-201A TSCD無菌導(dǎo)管接口機(jī);(3)美國COULTER/AC.TC 5diff A血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀;(4)英國西門子865血?dú)夥治鰞x及配套試劑盒(批號(hào):72497，54154);(5)顯微鏡和Nageotte白細(xì)胞計(jì)數(shù)板;(6)美國BD公司FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀，抗CD62p(Chrono-log，批號(hào) 09)，抗 CD41(Chrono-log，批號(hào) 35)，同型對(duì)照mouse IgG1 FITC、IgG1 PE;(7)美國Chronolog590-4D血小板凝聚儀和配套的血小板聚集誘導(dǎo)劑:ADP(批號(hào)3407)，膠原(批號(hào)3414);(8)瑞士SunRise-Basic TECAN酶標(biāo)儀;(9)山東威高一次性去白全血采血袋Q-400聯(lián)袋(1108241，1112151);(10)南京雙威FTS-PL白細(xì)胞過濾器(110412)(試驗(yàn)Ⅰ組);成都雙陸KF-WFP-B-IU白細(xì)胞過濾器(110813)(試驗(yàn)Ⅱ組，);單采血小板作為對(duì)照組;(11)去白混合濃縮血小板中任一男性獻(xiàn)血者血漿;(12)南京雙威二聯(lián)空袋(110605);(13)Turk’s溶液(自配)。

1.3 方法

1.3.1 去白混合濃縮血小板制備:將采集的400 ml/袋新鮮全血，保存在(22±2)℃，在4～6 h內(nèi)重離心，分離出白膜層(BC)(30～40 ml，其中血漿15～20 ml，BC 和紅細(xì)胞15～20 ml)，在(22±2)℃條件下靜置，次日將7袋檢驗(yàn)合格并且同血型的BCs通過無菌導(dǎo)管接口機(jī)匯集在二聯(lián)空袋內(nèi)，并加入提前挑選的其中一名男性獻(xiàn)血者的血漿200 ml(包括沖洗BC袋子所用)，輕輕混合均勻后離心，分離出混合濃縮血小板;將混合濃縮血小板通過無菌導(dǎo)管接口機(jī)與白細(xì)胞過濾器相連接，調(diào)節(jié)流量調(diào)節(jié)器，使混合PRP以快速滴狀經(jīng)過濾盒，過濾時(shí)間控制在12 min左右。過濾完畢熱合去掉濾器，即得去白混合濃縮血小板(以下簡稱“產(chǎn)品”)。

1.3.2 血小板和紅細(xì)胞殘留量計(jì)數(shù):用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組過濾前/后產(chǎn)品的血小板計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞混入量，根據(jù)容量計(jì)算每袋產(chǎn)品的血小板含量。

1.3.3 白細(xì)胞殘余量測定:制備當(dāng)天，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組的產(chǎn)品均用Nageotte計(jì)數(shù)法測定白細(xì)胞殘留量。用試管取產(chǎn)品 100 μl，加入 900 μl Turk，s溶液混勻，靜置10 min，再次震蕩試管后吸取約600 μl混合液滴入Nageotte計(jì)數(shù)板中，室溫沉降15 min后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)1個(gè)滿格子(5 μl)上的白細(xì)胞，樣品按1∶10稀釋，計(jì)算結(jié)果為每格中 WBCs/μl。計(jì)算公式:每袋中白細(xì)胞個(gè)數(shù)=白細(xì)胞實(shí)測值×10×103×容量/100。

1.3.4 血小板抗低滲休克反應(yīng)(HSR)測定

1.3.4.1 樣本的制備 每袋產(chǎn)品均用無菌接口機(jī)將母袋與二聯(lián)空袋相連接，取產(chǎn)品10 ml后熱合與母袋離斷，離心分離出貧血小板血漿(PPP)用于稀釋樣本用;另接一空袋取產(chǎn)品10 ml，吸取適量，根據(jù)血小板計(jì)數(shù)用PPP稀釋成濃度為(250～300)×109/L的樣本。

1.3.4.2 HSR 的測定 用 SunRise-Basic TECAN 酶標(biāo)儀測定試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組制備當(dāng)天產(chǎn)品的HSR，波長630nm。樣本與蒸餾水按1∶2比例混合，用蒸餾水調(diào)零，測定最小吸光度T0和該樣本15 min后的吸光度T15;樣本與產(chǎn)品自身的 PPP按1∶2比例混合，用PPP調(diào)零，測最大吸光度Tmax，HSR恢復(fù)率=(A15－A0)/(Amax－A0)×100%。

1.3.5 pH值和代謝產(chǎn)物的測定:用血?dú)鈨x和配套試劑盒測定試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組產(chǎn)品制備當(dāng)天的pH值，葡萄糖 (mmol/L)、乳酸鹽 (mmol/L)、PCO2(mm Hg)、PO2(mm Hg)和碳酸氫鹽以及鈉離子、鉀離子、氯離子的含量。

1.3.6 血小板聚集功能測定:用590系列電阻聚集儀測定血小板聚集率，當(dāng)電極插入裝有磁棒和血小板濃縮液的反應(yīng)杯中時(shí)，在電極的表面立刻附著一層血小板，加入誘導(dǎo)劑后大量血小板進(jìn)一步聚集。在此電極回路中，因血小板聚集電阻增加，電流減少，儀器通過檢測電阻的變化來確定血小板的聚集率。分別用ADP(10 μmol/L)和膠原(2 μg/ml)測定試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組產(chǎn)品第1天的電阻值。測定前將產(chǎn)品用PPP稀釋至濃度為(250～300)×109/L的樣本。

1.3.7 用流式細(xì)胞儀測定試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組產(chǎn)品的血小板CD62p陽性率。取2支流式細(xì)胞儀專用試管，分別標(biāo)記為對(duì)照管和測定管并分別加入同型對(duì)照mouse IgG1 FITC、IgG1 PE;測定管再加入CD41-FITC、CD62p-PE;加入處理好的標(biāo)本，混勻避光反應(yīng)20 min;用1%多聚甲醛4℃固定血小板，10 min后用流式細(xì)胞儀測定 CD62p陽性表達(dá)率(用流式細(xì)胞儀內(nèi)置的Cellquest軟件分析)。

1.4 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)GB18469-2012《全血及成分血質(zhì)量要求》中去白單采血小板的要求:血小板含量≥2.5 ×1011/袋，紅細(xì)胞混入量≤8.0 ×109/袋，pH 值為6.4 ～7.4。白細(xì)胞混入量≤5.0 ×106/袋，無細(xì)菌生長。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)行成對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組過濾前后血小板回收率情況 2組產(chǎn)品過濾后回收率在90%以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 2組過濾前后血小板回收率情況±s

表1 2組過濾前后血小板回收率情況±s

組別 濾前(×1011/袋) 濾后(×1011/袋) 回收率(%) t值 P 值 細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)Ⅰ組(n=35) 2.90 ±0.39 2.62 ±0.26 90.34 ±2.32 4.996 0.000無菌生長試驗(yàn)Ⅱ組(n=25) 2.93 ±0.35 2.71 ±0.29 92.49 ±1.17 7.023 0.000無菌生長

2.2 2組去白混合濃縮血小板的質(zhì)量變化情況 2組產(chǎn)品血小板的含量和紅細(xì)胞的殘留量均符合單采血小板的標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品白細(xì)胞的殘留量比去白細(xì)胞單采血小板標(biāo)準(zhǔn)低數(shù)10倍，比普通單采血小板低數(shù)千倍。見表2。

表2 2組去白混合濃縮血小板的質(zhì)量變化情況±s

表2 2組去白混合濃縮血小板的質(zhì)量變化情況±s

項(xiàng)目 試驗(yàn)Ⅰ組(n=35) 試驗(yàn)Ⅱ組(n=25) t值 P值容量(ml)294.00 ±37.00 290.00 ±34.00 0.347 0.730血小板含量(×1011/袋) 2.62 ±0.26 2.71 ±0.29 1.258 0.213 MPV(fl) 6.78 ±0.53 6.93 ±0.29 1.329 0.189 RBC 混入量(×109/袋) 6.16 ±2.98 6.13 ±2.11 0.047 0.963 WBC混入量(×106/袋)0.15 ±0.14 0.15 ±0.16 0.231 0.818

2.3 3組去白混合濃縮血小板的功能變化情況 t1、p1分別為試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組的值，t2、p2分別為試驗(yàn)Ⅱ組與對(duì)照組的值，t3、p3分別為試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組的值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。抗低滲休克反應(yīng)試驗(yàn)Ⅰ組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);試驗(yàn)Ⅱ組低于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。活化標(biāo)志物CD62p試驗(yàn)Ⅰ組合試驗(yàn)Ⅱ組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。膠原誘導(dǎo)的聚集率比ADP誘導(dǎo)的聚集率高(P＜0.05)。見表3。

表3 3組去白混合濃縮血小板的功能變化情況±s

表3 3組去白混合濃縮血小板的功能變化情況±s

組別 HSR(%) CD62P(%) ADP聚集率(Ω)膠原聚集率(Ω)試驗(yàn)Ⅰ組(n=25) 72.34 ±40.05 6.10 ±1.60 11.25 ±8.50 18.33 ±6.42試驗(yàn)Ⅱ組(n=23) 43.75 ±23.53 5.56 ±3.50 8.30 ±3.83 18.87 ±6.18對(duì)照組(n=6) 66.47 ±6.81 8.32 ±0.91 14.30 ±2.94 23.50 ±1.87 t1 2.322 3.237 0.865 1.926 p1 0.028* 0.003* 0.394 0.064 t2 3.060 3.474 3.571 1.792 p2 0.005* 0.002* 0.001* 0.084 t3 3.301 0.722 1.155 0.592 p3 0.002*0.473 0.592 0.557

2.4 3組去白混合濃縮血小板第1天代謝指標(biāo)變化情況 t1、p1分別為試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組的值，t2、p2分別為試驗(yàn)Ⅱ組與對(duì)照組的值，t3、p3分別為試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組的值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩試驗(yàn)組的pH值符合GB18469-2012《全血及成分血質(zhì)量要求》對(duì)混合濃縮血小板的要求，但均與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩試驗(yàn)組之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);乳酸鹽和PCO2比較，試驗(yàn)Ⅱ組顯著大于試驗(yàn)Ⅰ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 3組去白混合濃縮血小板第1天代謝指標(biāo)變化情況±s

表4 3組去白混合濃縮血小板第1天代謝指標(biāo)變化情況±s

組別 pH值 葡萄糖(mmol/L)乳酸鹽(mmol/L)PCO2(mm Hg)PO2(mm Hg)試驗(yàn)Ⅰ組(n=25) 6.71 ±0.13 19.84 ±3.76 8.98 ±3.28 71.05 ±33.3239.61 ±42.13試驗(yàn)Ⅱ組(n=23) 6.49 ±0.17 19.79 ±1.36 6.83 ±3.20 113.70 ±48.99 57.43 ±45.43對(duì)照組(n=6) 6.88 ±0.17 21.32 ±1.36 2.27 ±0.48 61.38 ±4.65 30.72 ±27.50 t1 3.191 0.929 3.957 0.703 0.495 p1 0.003* 0.359 0.000* 0.486 0.623 t2 5.440 2.175 3.441 2.581 1.876 p2 0.000* 0.038* 0.002* 0.015* 0.085 t3 5.738 0.449 2.686 3.883 1.596 p3 0.000* 0.655 0.009* 0.000*0.116

3 討論

我國利用手工采集全血中血小板資源與歐洲國家相比有很大差距。2004年歐洲國家混合濃縮血小板的應(yīng)用比率范圍為10% ～98%。2007年德國臨床應(yīng)用混合濃縮血小板占40%，2008年達(dá)到97%，3%的單采血小板只用于需要HLA/HPA配型的患者［1］。面對(duì)國內(nèi)臨床對(duì)血小板需求量越來越大的現(xiàn)實(shí)，僅僅依靠單采血小板已不能滿足臨床需求，充分利用手工采集全血中血小板資源、制備去白混合濃縮血小板是解決血站與臨床血小板供需矛盾的有效途徑。

表1顯示，7袋BC匯集制備的產(chǎn)品，血小板含量能夠達(dá)到1個(gè)治療量，過濾后回收率在90%以上，表2顯示白細(xì)胞殘留量比標(biāo)準(zhǔn)要求的少數(shù)10倍，可以減少由白細(xì)胞引起的輸血反應(yīng)。BCs在22℃過夜保存期間，BCs中的白細(xì)胞仍有吞噬細(xì)菌的能力，通過過濾去除白細(xì)胞也去除了可能污染的細(xì)菌，可以減少患者輸注后的敗血癥風(fēng)險(xiǎn)。

HSR是檢測血小板在低滲環(huán)境中發(fā)生腫脹后，由膜的完整性和能量代謝使腫脹的血小板恢復(fù)其原有形狀的能力，測定HSR可以預(yù)測血小板在體內(nèi)的存活力［2］。表3顯示，試驗(yàn)Ⅰ組的HSR顯著高于對(duì)照組，而試驗(yàn)Ⅱ組顯著低于對(duì)照組，但2個(gè)試驗(yàn)組的血小板HSR范圍為54% ～82%，在文獻(xiàn)報(bào)道的40% ～80%范圍內(nèi)［2］，表明酶標(biāo)儀測定血小板HSR具有比較好的準(zhǔn)確性，操作簡便，需要的樣本量少，重復(fù)性好，檢測速度快，一次可以對(duì)多份樣本測定。

CD62p是血小板活化的重要指標(biāo)，CD62p存在于血小板α顆粒的內(nèi)表面，血小板未發(fā)生活化時(shí)其外表面不表達(dá)CD62P，一旦血小板受到各種刺激被激活時(shí)，其顆粒膜與質(zhì)膜發(fā)生融合，導(dǎo)致CD62p在質(zhì)膜上表達(dá)而被檢測到，成為活化血小板標(biāo)志。本研究測定的兩個(gè)試驗(yàn)組的CD62p均比對(duì)照組有顯著性差異，也比文獻(xiàn)報(bào)道［兩種濾器分別是(8.06 ±4.11)和(10.34±3.26)］［3］低。據(jù)報(bào)道匯集 BC 在離心過程中，有紅細(xì)胞和白細(xì)胞作緩沖，使血小板受到的切割力較小，減少了血小板的制備損傷，使以CD62p為代表的活性標(biāo)志物減少［4］。

本研究是用電阻法測定血小板的聚集率，同一誘導(dǎo)劑測出的電阻越大，說明血小板的聚集功能越好。血小板聚集率大小與使用的聚集誘導(dǎo)劑的種類有關(guān)，ADP是弱的誘導(dǎo)劑，膠原是強(qiáng)誘導(dǎo)劑，膠原能夠使血小板產(chǎn)生相當(dāng)多的α顆粒而使血小板聚集反應(yīng)增加。表3顯示，膠原誘導(dǎo)的聚集率2個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組沒有顯著性差異，而且顯著高于ADP誘導(dǎo)的聚集率(P＜0.05)，并與文獻(xiàn)報(bào)道的電阻法測定正常人的聚集率(ADP 為6 ～13 Ω，膠原為 10 ～18 Ω)［5］相一致，但與 文 獻(xiàn) 報(bào) 道 的 比 濁 法 (ADP 70.55%［3］，膠 原87.40%［6］)低。比濁法和電阻法是兩種不同的測定血小板聚集率的方法，據(jù)報(bào)道兩種方法的測定結(jié)果不具有可比性，特別在臨床檢測中不建議兩種方法替代使用［5］。

表4顯示，2個(gè)試驗(yàn)組的pH值符合GB18469－2012《全血及成分血質(zhì)量要求》對(duì)混合濃縮血小板的要求，但與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩試驗(yàn)組之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);乳酸鹽和PO2試驗(yàn)Ⅱ組顯著大于試驗(yàn)Ⅰ組(P＜0.05)。這可能與BC過夜保存和使用的血小板保存袋有關(guān):BC在過夜保存期間由于代謝產(chǎn)生CO2，當(dāng)制成產(chǎn)品后，能呼吸的血小板保存袋(試驗(yàn)I組)可以通透氣體，產(chǎn)生的CO2能夠從袋內(nèi)逸出，O2也能夠進(jìn)入保存袋內(nèi)，維持了介質(zhì)的pH值，不能呼吸的袋子(試驗(yàn)Ⅱ組)產(chǎn)生的CO2不能逸出，使得CO2分壓越來越大，pH值下降。

在提取BC時(shí)盡量減少血漿量，使混合血小板中來自各個(gè)獻(xiàn)血者的血漿量盡量少，再用其中1名男性獻(xiàn)血者血漿作為懸浮介質(zhì)，可以減少 TRALI發(fā)生率［7］;血小板含量能夠達(dá)到1個(gè)治療量，方便臨床輸注，可以作為單采血小板供應(yīng)不足的補(bǔ)充，使更多的需要輸注血小板的患者得到治療;能夠?qū)崿F(xiàn)血液資源的綜合利用，減少浪費(fèi);為研究去白混合濃縮血小板的制備工藝和制定標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。

血站制定血小板的供應(yīng)策略，既要考慮患者的特殊需求，又有考慮現(xiàn)有的資源條件，對(duì)于未產(chǎn)生同種免疫的患者，可以輸注去白混合濃縮血小板，對(duì)于含有HLA抗體或HPA抗體的患者來說，需要輸注與患者抗原相匹配的單采血小板。為保證產(chǎn)品的質(zhì)量安全，不用第一次獻(xiàn)血者的血液制備本產(chǎn)品;從節(jié)約血液資源角度考慮，應(yīng)該充分利用手工采集全血中的血小板資源，除非有特殊的臨床需求。一個(gè)血站單采血小板和去白混合濃縮血小板都應(yīng)該開展，在全血采集量較少的季節(jié)比如節(jié)假日或患者的特殊需要應(yīng)考慮供應(yīng)單采血小板，在采血旺季應(yīng)提倡供應(yīng)去白混合濃縮血小板。

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