董 妍,胡文忠,何煜波,姜愛(ài)麗,薩仁高娃

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

食源性致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)中菌體分離富集與DNA提取技術(shù)研究進(jìn)展

董 妍1,胡文忠2,*,何煜波2,姜愛(ài)麗2,薩仁高娃3

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

食源性致病菌DNA的數(shù)量及純度嚴(yán)重影響后續(xù)分子生物學(xué)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性,因此隨著分子生物學(xué)技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用日漸廣泛,細(xì)菌的分離、富集和DNA提取方法成為研究熱點(diǎn)之一。本文綜述了食源性致病菌的分離、富集和DNA提取的多種方法,以便研究開(kāi)發(fā)更加快速、靈敏的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

食源性致病菌,分離,富集,DNA提取,分子生物學(xué)

近年來(lái),由食源性致病菌污染食品而引起的食品安全問(wèn)題在全球范圍內(nèi)頻頻發(fā)生,如2008年荷蘭暴發(fā)的沙門(mén)氏菌污染奶酪和肉制品事件、2011年美國(guó)暴發(fā)的香瓜李斯特菌中毒事件、2014年日本發(fā)生的腸出血性大腸桿菌O157∶H7大規(guī)模污染黃瓜事件等,造成消費(fèi)者感染和死亡,嚴(yán)重危害了人類(lèi)生命健康,給食源性疾病的預(yù)防及控制工作帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn),因此,食源性致病菌的快速檢測(cè)技術(shù)成為了國(guó)內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點(diǎn)之一。食源性致病菌的傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越不能滿(mǎn)足人們當(dāng)今對(duì)食品質(zhì)量與安全的要求,隨著食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展,分子生物學(xué)技術(shù)因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)食品的食源性致病菌的檢測(cè)中。DNA提取是分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一,所提取的DNA的含量和質(zhì)量不僅影響到檢測(cè)的速度,也影響著檢測(cè)的特異性和靈敏性。在食品中食源性致病菌的數(shù)量往往較少,而且存在著食品中的復(fù)雜基質(zhì)影響分子生物學(xué)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性。因此,檢測(cè)前對(duì)食源性致病菌進(jìn)行分離、富集或選擇高效的DNA提取方法是實(shí)現(xiàn)快速、特異、靈敏檢測(cè)的重要基礎(chǔ)。本文對(duì)食源性致病菌的分離、富集方法以及其DNA的幾種提取方法進(jìn)行了綜述,以期為食源性致病菌的監(jiān)督與檢測(cè)、食源性疾病的預(yù)防與控制提供參考。

1 食源性致病菌的分離、富集技術(shù)

1.1 離心分離技術(shù)

離心分離技術(shù)主要是根據(jù)不同物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度等因子的不同,利用離心力將菌懸液中的菌體與細(xì)菌培養(yǎng)液分開(kāi),使菌體脫離培養(yǎng)基質(zhì)而富集在一起。離心分離技術(shù)普遍具有快速、簡(jiǎn)便、成本低等特點(diǎn),特別是應(yīng)用密度梯度離心技術(shù)可以分離不同種類(lèi)的細(xì)菌,是一種應(yīng)用較廣泛的富集方法,但是離心分離技術(shù)還存在著粘附食品基質(zhì)、大量細(xì)菌損失等缺點(diǎn)[1]。李引強(qiáng)[2]等人在應(yīng)用試劑盒法提取牛奶樣品中細(xì)菌DNA前,對(duì)樣品進(jìn)行了離心處理,基于16S rRNA-V3區(qū)克隆測(cè)序鑒定了細(xì)菌菌群,研究發(fā)現(xiàn)此方法可以提取到市售牛奶中的細(xì)菌DNA,并滿(mǎn)足下游的實(shí)驗(yàn)要求。吳家林[3]等人用差速離心技術(shù)對(duì)豬肉模擬樣品進(jìn)行前處理,在應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸桿菌O157∶H7時(shí),樣品預(yù)增菌4 h后檢測(cè)靈敏度能達(dá)到100CFU/mL。Fukushima[4]等人應(yīng)用浮力密度梯度離心對(duì)食品中沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等12種致病菌進(jìn)行了分離并富集,應(yīng)用活細(xì)胞計(jì)數(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),富集后的菌體濃度是富集前的250倍,檢測(cè)靈敏度為101～103CFU/g。

1.2 改良?jí)埦囵B(yǎng)基富集法

應(yīng)用増菌培養(yǎng)基的前増菌過(guò)程可以增加致病菌的數(shù)量,從而有效提高致病菌的濃度,特別是選擇性増菌能夠抑制雜菌,提高檢出率和準(zhǔn)確性。對(duì)増菌培養(yǎng)基的改良主要體現(xiàn)在提高増菌效率、研究共増菌培養(yǎng)基等方面[5]。于海霞[6]等人對(duì)山梨醇麥康凱培養(yǎng)基和M-WS培養(yǎng)基對(duì)食品檢驗(yàn)中腸出血性大腸桿菌O157∶H7的分離能力進(jìn)行了比較研究,M-WS培養(yǎng)基表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗雜菌干擾的能力,提高了食品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7的分離效率和檢出率。呂曉萌[7]等人對(duì)PCR法檢測(cè)大腸桿菌的增殖條件進(jìn)行了優(yōu)化研究,研究發(fā)現(xiàn)在LB培養(yǎng)基中添加0.3 g/100 mL的甘露醇和1.0%的乳糖,并輔以37 ℃、150 r/min的振蕩培養(yǎng),大腸桿菌的增殖效果最佳。翁思聰[8]等人設(shè)計(jì)了一種復(fù)合型増菌培養(yǎng)基可以使副溶血性弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌等4種水產(chǎn)品中常見(jiàn)的致病菌在同一培養(yǎng)基中生長(zhǎng),減少了培養(yǎng)基對(duì)多重PCR檢測(cè)的影響,大幅度提高了檢測(cè)效率。趙廣英[9]等人以魚(yú)蛋白胨為基礎(chǔ),改良了水產(chǎn)品中副溶血弧菌的増菌培養(yǎng)基,取得了較好的富集效果。

1.3 膜分離技術(shù)

高分子薄膜以壓力差、濃度差等外界能量位差為推動(dòng)力,可以對(duì)致病菌進(jìn)行分離和富集。膜分離技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、成本低等特點(diǎn)。但是分離后的細(xì)菌常濃縮于食品或?yàn)V膜上,還需要進(jìn)一步洗脫和分離,并且洗脫效果嚴(yán)重影響著細(xì)菌的回收率,胡朝友[10]等人對(duì)僅輔以渦旋的膜洗脫方法進(jìn)行了回收率的研究,發(fā)現(xiàn)較低濃度的菌體應(yīng)用膜洗脫方法的回收率較低,濃度最低的回收率不足20%,針對(duì)此問(wèn)題對(duì)應(yīng)用濾膜富集飲用水中大腸桿菌的方法進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明在膜過(guò)濾前向水樣中加入高濃度表皮葡萄球菌可以提高低濃度大腸桿菌的洗脫效率,并在膜過(guò)濾后采用渦旋和玻璃棒刮擦的方法處理濾膜,洗脫效率達(dá)74%～95%,對(duì)1000 mL不同濃度大腸桿菌進(jìn)行富集和DNA提取后,全程的回收率為79.7%～104.0%,結(jié)合TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的靈敏度為1 CFU/mL。Fitzmaurice[11]等人比較了膜分離技術(shù)和免疫磁性分離技術(shù)分別對(duì)牛肉樣品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7的富集能力,結(jié)合多重PCR反應(yīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)菌增殖時(shí)間大于16 h時(shí),牛肉樣品中菌含量達(dá)到log109.6-7.5CFU/mL,膜分離技術(shù)可以達(dá)到與免疫磁性分離技術(shù)相當(dāng)?shù)母患芰Αeníková[12]等人在對(duì)食品中沙門(mén)氏菌應(yīng)用IMS-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)前,將預(yù)富集樣品通過(guò)應(yīng)用膜分離技術(shù)制成的過(guò)濾袋,以去除食物殘?jiān)?降低了食物基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的負(fù)面影響,提高了檢測(cè)效率。

1.4 免疫磁性分離技術(shù)

免疫磁性分離技術(shù)利用相關(guān)抗體能夠與細(xì)菌細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合的原理,以磁性物質(zhì)為中介,在外磁場(chǎng)的作用下將致病菌從培養(yǎng)環(huán)境中分離出來(lái)。免疫磁性分離技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點(diǎn),但同時(shí)也存在著成本高、需要預(yù)處理、不適合大體積樣品分離等缺點(diǎn)[1]。Xiong[13]等人對(duì)檢測(cè)食品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7的免疫磁性分離技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后對(duì)細(xì)菌數(shù)量為101～106CFU/mL、磁珠用量為0.05 mg的腸出血性大腸桿菌O157∶H7捕獲效率大于98%,對(duì)碎牛肉和牛奶樣品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7的捕獲效率分別為94.4%和99.8%。Ma[14]等人使用基于免疫磁性分離技術(shù)的多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)新鮮豬肉中的沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌,靈敏度分別為2.0、6.8、9.6 CFU/g。Wang[15]等人將免疫磁性分離技術(shù)、疊氮溴化丙錠(PMA)、脫氧膽酸鈉(SD)與qPCR技術(shù)結(jié)合檢測(cè)牛奶樣品中的腸出血性大腸桿菌O157∶H7,消除了死菌對(duì)檢測(cè)的干擾,檢出限為102CFU/mL。Zheng[16]等人應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR法結(jié)合免疫磁性分離技術(shù)對(duì)鴨翅原料中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)時(shí)間為10 h,檢出限為103CFU/mL。

近年來(lái),納米級(jí)磁性材料被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的分離中,納米級(jí)磁性材料比普通的磁性微珠更加穩(wěn)定,并且在擴(kuò)散速度、與目標(biāo)菌的結(jié)合能力等方面更強(qiáng),具有快速、高效、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),但是同時(shí)也存在著對(duì)環(huán)境要求高、分離體積小等缺點(diǎn)[1]。鐘子清[17]等人比較了抗體直接偶聯(lián)、鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)偶聯(lián)的納米級(jí)免疫磁珠以及磁珠大小對(duì)單增李斯特菌捕獲效率的影響,研究發(fā)現(xiàn)采用鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)偶聯(lián)的180 nm免疫磁珠可以高效的富集單增李斯特菌。Yang[18]等人應(yīng)用納米級(jí)免疫磁性粒子結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)牛奶樣品中的單增李斯特菌,捕獲效率是普通免疫磁性分離的1.4～26倍,檢測(cè)的靈敏度為452 CFU/mL。Yang[19]等人應(yīng)用納米磁珠分離食品中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7和李斯特菌菌細(xì)胞,并結(jié)合PMA-PCR檢測(cè)技術(shù),食品樣本中的檢出限為103CFU/mL。

2 食源性致病菌DNA的提取技術(shù)

2.1 有機(jī)溶劑抽提法

有機(jī)溶劑抽提法在致病菌DNA提取中應(yīng)用較為廣泛,也是許多改良方法的基礎(chǔ),主要是利用蛋白酶K等破碎菌細(xì)胞,用酚-氯仿等有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì),最后用乙醇等沉淀DNA。此方法雖然提取效率較高、DNA純度較好,但存在著操作繁瑣、干擾后續(xù)反應(yīng)、有一定毒性等缺點(diǎn)。Gordillo[20]等人對(duì)肉制品中的腸出血性大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行煮沸冷卻和溶菌酶處理后,應(yīng)用酚/氯仿混合物、乙醇等有機(jī)物提取DNA,結(jié)合qPCR技術(shù)檢測(cè),富集后檢測(cè)限為1 CFU/g,檢測(cè)時(shí)間8 h。Fakruddin[21]等人應(yīng)用酚/氯仿-乙醇方法分離斑節(jié)對(duì)蝦中出血性大腸桿菌O157∶H7、沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌和副溶血性弧菌的DNA,并結(jié)合多重PCR反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè),獲得了良好的特異性和靈敏性。Kawasaki[22]等人對(duì)肉類(lèi)、魚(yú)等食品中沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行了多重PCR檢測(cè),應(yīng)用異硫氰酸胍和異丙醇等有機(jī)物提取細(xì)菌DNA,經(jīng)20 h増菌的人工接種樣品的檢出限為5 CFU/25 g,同時(shí)對(duì)食品在冷凍儲(chǔ)藏期內(nèi)致病菌的檢出率進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。

2.2 水煮法

水煮法利用高溫破碎菌細(xì)胞,并使蛋白質(zhì)變性而收集DNA。此方法簡(jiǎn)單、快速,且成本較低。但同時(shí)應(yīng)用水煮法提取食品樣品中致病菌的DNA時(shí),DNA的純度在很大程度上會(huì)受到食品樣品種類(lèi)的影響,陳偉[23]等人應(yīng)用水煮法提取肉制品中志賀氏菌的DNA,以研究其對(duì)PCR檢測(cè)靈敏度的影響,此方法所提取DNA的OD260/OD280的值為1.0252,檢出限為5×103CFU/mL,分析認(rèn)為應(yīng)用水煮法處理肉制品使得產(chǎn)物中含有大量的蛋白質(zhì)等雜質(zhì),降低了產(chǎn)物的純度,從而影響檢測(cè)的靈敏度。Zarei[24]等人應(yīng)用水煮法提取多種肉類(lèi)產(chǎn)品中的腸出血性大腸桿菌O157∶H7和單增李斯特菌的DNA,結(jié)合多重PCR反應(yīng)分析了伊朗西南部肉類(lèi)商品中兩種致病菌的檢出率。Kim[25]等人在應(yīng)用熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)鮮切甘藍(lán)中腸出血性大腸桿菌時(shí),采用水煮法提取細(xì)菌DNA,檢測(cè)時(shí)間少于9 h,檢出限為1.53 log CFU/mL。Son[26]等人應(yīng)用水煮法對(duì)五種產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌提取DNA,進(jìn)行了多重PCR反應(yīng)檢測(cè)并應(yīng)用于人工接種的菠菜、苜蓿芽和香菜中,此方法具有快速、特異的特點(diǎn)。

2.3 Triton X-100裂解法

Triton X-100化學(xué)名稱(chēng)為聚乙二醇辛基苯基醚,是烷基酚與環(huán)氧乙烷的縮合物,屬于非離子型表面活性劑,可使膜蛋白充分溶解從而分離DNA,此方法簡(jiǎn)單、快速。但當(dāng)使用此方法提取某些具有莢膜等結(jié)構(gòu)的細(xì)菌時(shí)所得DNA的純度不高,蘇麗婷[27]等人對(duì)應(yīng)用Triton X-100裂解法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)所提取DNA的OD260/OD280值一般在0.69左右,PCR檢測(cè)的靈敏度不高。Vidal[28]等人對(duì)引起食源性疾病暴發(fā)的三種致瀉性大腸桿菌(腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌)進(jìn)行多重PCR檢測(cè)時(shí),采用了0.5%的Triton X-100煮沸提取致病菌的DNA。徐偉[29]等人分別用Triton X-100法、溶菌酶+蛋白酶K法、Tween-20法提取滅菌脫脂乳中的單增李斯特菌和志賀氏菌DNA,進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),Triton X-100法和Tween-20法符合檢測(cè)要求,應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測(cè)后,檢出限分別為2 CFU/25 mL、1.6 CFU/25 mL。魏華[30]等人比較了水煮法、Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法對(duì)大腸桿菌DNA的提取效果,并結(jié)合ERIC-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明三種提取方法效果一致,均可獲得應(yīng)用于ERIC-PCR技術(shù)的有效擴(kuò)增模板。

2.4 Chelex-100法

Chelex-100是一種聚苯乙烯基體離子交換樹(shù)脂,該樹(shù)脂懸液可以在堿性、100 ℃的條件下破碎菌細(xì)胞并使蛋白質(zhì)變性,從而釋放DNA。Chelex-100法可螯合金屬離子,在煮沸過(guò)程中能夠保護(hù)DNA并減少抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì),操作簡(jiǎn)單、快速,但其所提取的DNA純度不如用試劑盒法所提取DNA的純度[31],并且所提取的DNA保存時(shí)間超過(guò)6個(gè)月會(huì)影響PCR實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性[32]。錢(qián)雪琴[33]等人采用Chelex-100法提取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的DNA,利用通用引物擴(kuò)增16SrDNA片段檢測(cè)兩種菌的靈敏度均為1.2×101CFU/mL。鄭鳴[34]等人將Chelex-100法與環(huán)介導(dǎo)間接聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合檢測(cè)肉制品中的單增李斯特菌,人工污染的鮮肉和牛奶檢的靈敏度均為100 CFU/g(mL),對(duì)市場(chǎng)上200份不同的肉制品進(jìn)行了檢測(cè),陽(yáng)性率與傳統(tǒng)培養(yǎng)法一致。Malorny[35]等人應(yīng)用Chelex-100法提取食品中的沙門(mén)氏菌并應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),對(duì)多株沙門(mén)氏菌菌株和非沙門(mén)氏菌菌株檢測(cè)的檢出率為100%時(shí),檢出限為104CFU/mL,對(duì)110種食品樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性為100%。

2.5 FTA濾膜法

FTA(Flinders Technology Associates,FTA)濾膜或FTA卡是一種特制的濾膜,它可以裂解細(xì)胞并將DNA吸附在其上,經(jīng)干燥后長(zhǎng)期保存DNA。此方法能夠去除雜質(zhì)及抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì),無(wú)需洗脫DNA避免了DNA的損失,簡(jiǎn)單快速。Lampel[36]等人將FTA濾膜法與PCR反應(yīng)結(jié)合,分別對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、牛肉等幾種食品中的志賀氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和李斯特菌進(jìn)行了檢測(cè),志賀氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的靈敏度為30～50 CFU/mL,李斯特菌的靈敏度為200 CFU/mL。任立松[37]等人應(yīng)用水煮法、FTA濾膜法、試劑盒法分別對(duì)阪崎腸桿菌提取DNA,并應(yīng)用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中,發(fā)現(xiàn)應(yīng)用FTA濾膜法和試劑盒法提取DNA效果優(yōu)于水煮法,FTA濾膜法更簡(jiǎn)單、快速,靈敏度為103CFU/mL。但是應(yīng)用此方法時(shí)需對(duì)濾膜大小等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,并且卡片本身含有少量抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì),陳霖祥[38]等人針對(duì)此問(wèn)題對(duì)FTA樣品卡的大小和卡片上DNA提取量進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)6.0×104-7CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液制備的0.5 mm卡片在熒光PCR-16S rDNA測(cè)序反應(yīng)中Cp值較好。

2.6 磁性材料吸附法

選擇與致病菌特異性基因片段互補(bǔ)的寡核苷酸片段修飾磁性材料,可以選擇性的分離目標(biāo)DNA,此方法具有靈敏、快速、雜質(zhì)干擾小的特點(diǎn),但是對(duì)生物親和分子和磁場(chǎng)的要求高[1]。Amagliani[39]等人應(yīng)用順磁性納米粒子分離牛奶樣品中的李斯特菌,結(jié)合PCR檢測(cè)技術(shù),靈敏度為10 CFU/mL,與應(yīng)用柱分離技術(shù)商品提取的DNA相比,靈敏度提高了10倍。隨后Amagliani[40]等人還使用了氨基改性的順磁性納米粒子分離海產(chǎn)品中的沙門(mén)氏菌和李斯特菌的DNA,結(jié)合三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)技術(shù),能夠?qū)埦凹?xì)菌濃度為1 CFU/g的樣品進(jìn)行檢測(cè),與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法結(jié)果一致。Omiccioli[41]等人采用磁性材料從牛奶樣品中提取沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7的DNA,并應(yīng)用于多重PCR反應(yīng)中,能夠檢測(cè)出菌濃度為10 cells/mL的牛奶樣品。

3 展望

目前,食品安全問(wèn)題是全球關(guān)注的焦點(diǎn),其中由食源性致病菌引起的食源性疾病因具有高發(fā)病率、高致死率、傳播能力強(qiáng)等特點(diǎn),成為食品安全問(wèn)題中的首要問(wèn)題,據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年發(fā)生細(xì)菌性食物中毒占食物中毒事件的30%～90%,其中人數(shù)占60%～90%[42]。食品基質(zhì)會(huì)對(duì)其中致病菌DNA的分離和提取造成很大的影響,繼而影響檢測(cè)的靈敏性。食品基質(zhì)主要的影響作用體現(xiàn)在兩方面:一是食品基質(zhì)經(jīng)破碎處理后,殘留物質(zhì)與致病菌相比體積依然較大,此時(shí)致病菌會(huì)粘附在食品基質(zhì)上,不利于分離,造成所得致病菌數(shù)量小于實(shí)際食品中致病菌的數(shù)量,易造成漏檢的結(jié)果[1];二是食品基質(zhì)中存在著干擾PCR檢測(cè)的物質(zhì),比如在肉制品中存在著脂肪、金屬離子等抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)[23],在乳品中抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要是脂肪、多糖、蛋白質(zhì)等[43],并且不同食品基質(zhì)中同種抑制因子也會(huì)對(duì)PCR檢測(cè)產(chǎn)生不同影響,楊洋[44]等人研究發(fā)現(xiàn)從全脂乳和脫脂乳中提取金黃色葡萄球菌的DNA,與從干酪中提取金黃色葡萄球菌的DNA相比,前者用于PCR檢測(cè)的效果更好,主要原因是后者的脂肪含量遠(yuǎn)高于前者,影響了致病菌DNA的提取和PCR檢測(cè)。因此,對(duì)不同種類(lèi)食品中的食源性致病菌建立快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù),對(duì)有效控制食源性致病菌的傳播、預(yù)防食源性疾病的暴發(fā)至關(guān)重要。研究在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的、高純度的細(xì)菌基因組DNA的富集、提取方法以滿(mǎn)足檢測(cè)效率、檢出限的要求,具有著重要的實(shí)際意義。

在今后的研究中,對(duì)食源性致病菌的分離、富集以及DNA提取的研究主要發(fā)展趨勢(shì)主要有以下四點(diǎn)。首先,要簡(jiǎn)化DNA提取步驟,避免反復(fù)提取而造成DNA的損失,同時(shí)也能夠縮短提取時(shí)間,從而提高檢測(cè)效率。第二,要加強(qiáng)對(duì)提高DNA純度的研究,在分離、富集過(guò)程中盡量選擇特異性富集,提取過(guò)程中盡量去除蛋白質(zhì)、RNA等物質(zhì),以滿(mǎn)足分子生物學(xué)技術(shù)高特異性、高靈敏性的要求。第三,避免采用對(duì)PCR反應(yīng)抑制作用強(qiáng)烈、對(duì)環(huán)境有污染、破壞DNA的富集和提取方法。第四,要研究具有較強(qiáng)分離能力的分離方法,并針對(duì)不同樣品中抑制PCR反應(yīng)物質(zhì)的特點(diǎn),采用適合的提取方式。

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Research progress in separation,enrichment and DNA extraction of foodborne pathogens based on molecular biological technology

DONG Yan1,HU Wen-zhong2,*,HE Yu-bo2,JIANG Ai-li2,SA-Ren-gao-wa3

(1.College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

The quantity and purity of foodborne pathogens’ DNA affect the accuracy and sensitivity of molecular biological technology seriously. The separation,enrichment and DNA extraction of bacteria in detecting foodborne pathogens become research hotspot with the application of molecular biological technology. In this paper,the separation,enrichment and DNA extraction of foodborne pathogens are summarized to development more rapid and sensitive molecular biological technology.

foodborne pathogens;separation;enrichment;DNA extraction;molecular biology

2015-02-09

董妍(1989-),女,在讀碩士,研究方向:食品安全,E-mail:dong_yan@126.com。

*通訊作者:胡文忠(1959-),男,博士,教授,研究方向:食品科學(xué),E-mail:hwz@dlnu.edu.cn。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD38B05);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172009);大連科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012E13SF106)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)23-0371-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.069